【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
,具体涉及人体免疫活性细胞(DCCIK)制剂的制备方法及应用。
技术介绍
免疫治疗已被公认是肿瘤手术、化疗和放疗之外的最为重要的手段,对清除肿瘤患者体内的微转移肿瘤细胞,防止肿瘤的转移和复发以及提高患者生存率和生活质量具重要作用。肿瘤的特异性主动免疫治疗和被动过继免疫治疗研究。近20年来,取得了巨大进步(1)鉴定和纯化了起免疫活化功能的细胞因子(Miller DL,et al.Science.1982;215689-390),它可以增强机体对癌细胞的免疫应答。(2)开发出能选择性高效扩增特异性免疫效应细胞的方法,即获得大量特异性具杀伤肿瘤的T和NK细胞(GrimmEA,et al.J Exp Med.1982;1551823-1941),用于免疫治疗。(3)获得并了解了各种肿瘤特异性抗原的分子特性,例如MUC(Ioannides CG,et al.J Immunol.1993;1513693-3703)和PSA(Vesey SG,et al.Urology.1990;35483-486)等。(4)证实树突状细胞(Dendritic Cell,DC)是一个关键的抗原提呈细胞(AntigenPresenting Cells,APC)(Steinman RM.Annu Rev Immunol.1991;9271-296)起调控免疫作用。(5)认识到肿瘤细胞具有发展各种方式以逃避免疫系统的能力(Khong HT,et al.Nat Immunol.2002;3999-1005)。(6)确证免疫系统在剔除具有免疫-刺激抗原的肿瘤细胞中起 ...
【技术保护点】
一种人体免疫活性细胞DCCIK抗肿瘤细胞制剂,其特征在于该制剂是通过下列方法制得的,(1)外周血单个核细胞PBMC的制备无菌条件下用血分器取肿瘤患者抗凝外周血,用生理盐水对倍稀释后,用淋巴细胞分离液Ficoll,1.077, 离心2000rpm×25’,分离得PBMC,再用Hanks液洗涤2次,镜下计细胞数,最后用无血清培养液AIM-V调节细胞密度使成4×10↑[6]/ml细胞悬液;(2)非粘附与粘附细胞分离将细胞悬液移入6孔板Nuclon,37 ℃,5%CO2,培养2-6h,然后用移液管轻轻冲吸细胞,将非粘附细胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用,粘附细胞就留在6孔板上,加入DC培养液3ml/孔待用;(3)非粘附CIK细胞的诱导和扩增把离心管中的非粘附细胞悬液接 种到含有IFN-γ1000U/mlAIM-V培养液的25cm↑[2]培养瓶,100ml/瓶,置37℃,5%CO2培箱中24-36h后,把用Hanks液配制的抗CD3单抗5μg/ml包被25cm↑[2]培养瓶,同时加入终浓度IL-1β ...
【技术特征摘要】
1.一种人体免疫活性细胞DCCIK抗肿瘤细胞制剂,其特征在于该制剂是通过下列方法制得的,(1)外周血单个核细胞PBMC的制备无菌条件下用血分器取肿瘤患者抗凝外周血,用生理盐水对倍稀释后,用淋巴细胞分离液Ficoll,1.077,离心2000rpm×25’,分离得PBMC,再用Hanks液洗涤2次,镜下计细胞数,最后用无血清培养液AIM-V调节细胞密度使成4×106/ml细胞悬液;(2)非粘附与粘附细胞分离将细胞悬液移入6孔板Nuclon,37℃,5%CO2,培养2-6h,然后用移液管轻轻冲吸细胞,将非粘附细胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用,粘附细胞就留在6孔板上,加入DC培养液3ml/孔待用;(3)非粘附CIK细胞的诱导和扩增把离心管中的非粘附细胞悬液接种到含有IFN-γ 1000U/ml AIM-V培养液的25cm2培养瓶,100ml/瓶,置37℃,5%CO2培箱中24-36h后,把用Hanks液配制的抗CD3单抗5μg/ml包被25cm2培养瓶,同时加入终浓度IL-1β 100U/ml AIM-V,IL-2300U/mlAIM-V继续培养48-72h,镜下计数,用CIK培养液调细胞密度为4×105/ml,每隔48h按上述相同条件扩增1次,培养至第5-7天即收集CIK细胞备用;抗CD3单抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3单抗,使成为抗CD3单抗浓度为5~10μg/ml的包被液,在25cm2培瓶中加入5ml包被液,4℃过夜或者37℃温育2h后,弃去全部包被液即可;(4)粘附DC细胞的诱导和扩增在留有粘附细胞的6孔板上,每孔添加DC培液3ml内含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml,于37℃,5%CO2培养2天后,在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml),每天加1次,共3次,连续刺激3天后,于第5-7天收集细胞备用;(5)DC与CIK 1∶5混合共培养制取DCCIK细胞取培养至第5-7天之DC和CIK细胞,计数,离心,分别收集DC和CIK细胞,用AIM-V无血清培液调两细胞的密度分别为2×105和1×106,按DC∶CIK=1∶5等体积混合后移入25cm2培养瓶10ml/瓶,于37℃,5%CO2培养,每隔48-72h按以上细胞密度分瓶扩大培养1次,经5次扩大培养后即可获5×109~1×1010的DCCIK细胞;(6)DCCIK细胞制剂离心收集1~5×109细胞,用0.9%氯化钠注射液洗涤2次,离心,弃上清,将细胞移至250ml输液瓶中,加2g人血清白蛋白和250ml 0.9%氯化钠注射液,制成细胞悬液制剂。2.一种人体免疫活性细胞DCCIK抗肿瘤细胞制剂的制备方法,其特征在于该方法包括下列步骤(1)外周血单个核细胞PBMC的制备无菌条件下用血分器取肿瘤患者抗凝外周血,用生理盐水等倍稀释后,用淋巴细胞分离液Ficoll,1.077,离心2000rpm×25’,分离得PBMC,再用Hanks液洗涤2次,镜下计细胞数,最后用无血清培养液AIM-V调节细胞密度使成4×106...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘祥麟,王定华,
申请(专利权)人:上海中科英达生物技术有限公司,
类型:发明
国别省市:31[中国|上海]
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