一种体外免疫细胞制剂的修饰方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种体外免疫细胞制剂的修饰方法及应用。该方法用MOG

【技术实现步骤摘要】
一种体外免疫细胞制剂的修饰方法及其应用
本专利技术涉及细胞生物学领域，具体涉及体外免疫细胞制剂的修饰方法及其应用。
技术介绍
多发性硬化(MS)是一种病因及发病机制尚未完全阐明的中枢神经系统(CNS)免疫炎性脱髓鞘/变性疾病，倾向于青壮年罹患，且呈慢性病程，反复发作，进行性运动功能障碍，甚至瘫痪，给家庭和社会带来沉重的负担。迄今为止，MS尚无有效的治愈手段，主要是抑制炎性脱髓鞘病变进展，防止急性期病变恶化及缓解期复发，对症和支持疗法以减轻神经功能障碍带来的痛苦。目前中国MS患者的治疗更是困难重重，包括FAD批准的用于治疗该病的药物，如β-干扰素(IFN-β)、醋酸格拉太咪尔(GA)、那他珠单抗(NTZ)、Fingolimod(FTY270)等(Deograciasetal.,2012)，虽能一定程度缓解症状，减少复发，但并非对所有患者均有效，且不能影响不可逆的功能障碍及疾病的进展。此外，最重要的是这些药物要么没有进入中国市场，要么价格昂贵。而MS患者需要长期或终生治疗，昂贵的费用使得绝大多数中国MS患者无法承受。因此，皮质类固醇仍然是目前中国MS患者的主要治疗药物，具有抗炎和免疫调节作用，可促进急性复发的恢复和缩短复发期病程，但不能改善恢复程度，长期应用不能防止复发，且可出现严重不良反应，如骨质疏松、肌肉萎缩、糖尿病等(MinagarA.,2013)。近几年干细胞移植为神经变性疾病的治疗提供了广阔的前景。造血干细胞(HSC)移植通过免疫重建，使CNS产生免疫耐受，以达到治疗目的，但HSC移植只有在MS患者其他治疗手段无效的情况下才考虑应用。神经干细胞(NSCs)是来源于神经组织或能分化为神经组织，具有自我更新能力和多向分化潜能的一类细胞，已成为治疗神经变性疾病的热点。随着NSCs研究的深入，越来越多的理论和技术问题有待进一步完善和规范：①NSCs的来源选择：NSCs在神经组织中的位置比较深，获得自体NSCs就会对机体造成一定的损伤；如果从胎儿体内获取NSCs，即使是流产的胎儿，也存在伦理问题。②NSCs的数量：研究发现，NSCs对神经行为功能改善有明显的剂量依赖性，低于一定剂量，不能改善功能，而自体很难获得足够量的NSCs。③NSCs的免疫反应：脑组织是一个相对免疫缺陷器官，NSCs具有低免疫原性的特点。在理论上，NSCs作为一种处于相对原始状态的细胞，不表达成熟细胞抗原。然而，大量实验证实，新分离的和传代的NSCs细胞膜表面均有MHCI类和II类分子表达，说明其仍然存在一定免疫原性，异体NSCs移植不可避免存在免疫排斥反应。④NSCs的安全性：体外培养的NSCs因传代过多而活力下降，生物学性状部分改变，作为转基因载体NSCs存在可能带来潜在致病基因，甚至发生恶性转变等问题，因此NSCs移植在体内的成瘤性问题及其增殖、分化和迁移等仍需长期观察(Joyceetal.,2010；Lukovicetal.,2015；Ratajczaketal.,2014)。MS是以髓鞘特异性自身反应性CD4+T细胞介导为主的自身免疫性疾病，一直以来Th1/Th2细胞反应失衡被认为在MS的发生发展中起重要作用。Th1和Th2是CD4+T细胞分化的，功能和细胞因子分泌方式相反的2种辅助性T(Th)细胞。Th1可分泌致炎性细胞因子，如IL-2、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、GM-CSF等，辅助细胞免疫，介导细胞毒作用；而IFN-γ、IL-1β等又可促进T细胞、巨噬细胞的活化和浸润，使炎性病灶进一步扩大(Jiangetal.,2006)。Th2可分泌IL-4、IL-10、TGF-β等，辅助体液免疫，对Th1细胞的增殖呈负反馈效应(Zhouetal.,2014)。在MS的病理过程中除Thl细胞外，由CD4+T细胞分化而来的Th17细胞似乎在MS中发挥更为重要作用。Th17细胞是独立于Th1和Th2细胞的Th细胞亚群，分泌IL-17为细胞因子，后者是一种较强的致炎性细胞因子，可诱导IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌，介导组织炎症及破坏(Kanakasabaietal.,2011)。其中Thl和Th17是MS的主要参与者，其表达与MS的严重程度呈正相关；而Th2细胞作为免疫调节细胞或抑制性T细胞，具有免疫调节、抗炎、髓鞘保护作用，能改善MS发病的严重程度(Munegowdaetal.,2011；Liuetal.,2013)。另外，巨噬细胞作为外周免疫系统重要的抗原递呈细胞(APC)，具有激活T细胞，迁移，包围死细胞及清除细胞碎片等多种生物学行为(Erogluetal.,2010)。系列研究发现，巨噬细胞是一种具有可塑性和多功能的细胞群体，其表型和功能状态可随微环境的改变发生明显变化，表现极大的特质性。近年来巨噬细胞的极化受到普遍关注，并受各种微环境信号的诱导与调节(Zhangetal.,2013)。Th1型细胞因子IFN-γ促使单核细胞向M1型巨噬细胞分化。M1型巨噬细胞作为APC参与Th1和Th17T细胞激活，由此产生的IFN-γ和TNF-α则可进一步使M1炎性巨噬细胞分化和激活，从而放大免疫炎性反应。因此，M1型巨噬细胞在MS疾病的发生发展中起重要的促进作用。M2型巨噬细胞则可由Th2型细胞因子IL-4和IL-10等分化和激活，参与介导Th2细胞和CD4+CD25+调节性T细胞的分化，为改善EAE炎性反应微环境，减少髓鞘脱失和神经元变性奠定了细胞分子基础(Mikitaetal.,2011；Jiangetal.,2014)。总而言之，免疫炎性是介导MS发病的重要机制，基于此我们可以设想一种新的MS干预治疗策略，即一种体外修饰免疫炎性细胞，使其功能发生逆转，然后回输的治疗方法。
技术实现思路
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)与MS具有许多相似的临床表现和病理过程，被认为是探讨MS治疗策略的理想动物模型。抑制Rho激酶(ROCK)表达目前被认为是治疗MS或神经变性病的潜在药物靶点。Fasudil作为选择性ROCK抑制剂，大量研究表明其具有调节免疫细胞，减轻微血管通透性增加，减少炎症细胞迁移及保护受损神经元等功能。我们知道MS是一个复发-缓解，且需要长期治疗的慢性疾病，虽然Fasudil显示了良好的治疗效果，但迅速明显的血管扩张作用，口服生物利用度很差，药物口服剂型的研发一直没有成功，长期使用的安全窗较小等因素限制了其在MS患者的临床应用。针对MS的发生机制、治疗现状及Fasudil治疗MS的优缺点，本专利技术提供以下各项：1.一种体外修饰免疫细胞的方法，所述方法包括将免疫细胞用Fasudil体外修饰。2.一种免疫细胞，所述免疫细胞用Fasudil体外修饰。3.一种制剂，所述制剂包含用Fasudil体外修饰的免疫细胞。4.根据1所述的方法、2所述的免疫细胞或3所述的制剂，其中所述免疫细胞是T细胞或巨噬细胞。5.根据1所述的方法、2所述的免疫细胞或3所述的制剂，其中所述免疫细胞分离自小鼠EAE模型。6.一种用于治疗神经变性疾病的试剂盒，所述试剂盒中包含2所述的免疫细胞或3中所述的制剂。7.根据6所述的试剂盒，所述神经变性疾病包括多发性硬化。8.2所述的免疫细胞或3所述的制剂在制备用于治疗神经变性疾病的试剂盒中的用途，所述治疗包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外修饰免疫细胞的方法，所述方法包括将免疫细胞用Fasudil体外修饰。

【技术特征摘要】
2016.11.10 CN 20161098979141.一种体外修饰免疫细胞的方法，所述方法包括将免疫细胞用Fasudil体外修饰。2.一种免疫细胞，所述免疫细胞用Fasudil体外修饰。3.一种制剂，所述制剂包含用Fasudil体外修饰的免疫细胞。4.根据权利要求1所述的方法、权利要求2所述的免疫细胞或权利要求3所述的制剂，其中所述免疫细胞是T细胞或巨噬细胞。5.根据权利要求1所述的方法、权利要求2所述的免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春云，郭尚德，尉杰忠，李艳花，肖保国，马存根，
申请(专利权)人：山西大同大学，
类型：发明
国别省市：山西,14