一种增加免疫细胞得率的方法技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，具体涉及一种增加免疫细胞得率的方法，本发明专利技术的增加免疫细胞得率的方法，包括人外周血稀释、免疫细胞的分离、冻存、复苏及诱导扩增培养步骤，通过提取、保存健康时的细胞，并在后期诱导扩增培养，大大提高了免疫细胞的得率，在冻存的过程中采用特有的细胞冻存液可有效的保持免疫细胞的活性，在诱导扩增培养的过程中加入了海带多糖，能够得到较高倍数的扩增和较高纯度的细胞，从而显著增加了免疫细胞的得率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学
，具体涉及。
技术介绍
免疫细胞具有自然杀伤和自我保护的特征，其中淋巴细胞具有免疫调节和自我复 制等特点，针对病毒、细菌、真菌感染的治疗均起到关键的作用，应用免疫细胞进行的免疫 细胞疗法在癌症治疗中具有很大的临床应用价值。免疫细胞疗法目前主要包括细胞因子诱 导的杀伤细胞(CIK)疗法、树突状细胞(DC)疗法、DC-CIK细胞疗法、自然杀伤细胞(NK)疗法、 DC-T细胞疗法等。 在健康人体的血液中含有丰富的免疫细胞，随着老龄化、亚健康、患上各种疾病等 原因，血液中免疫细胞的数量会明显呈下降趋势，增殖分化能力降低;而异体的免疫细胞移 植则可能引起患者体内的免疫排斥反应;如何增加免疫细胞的得率直接影响了免疫细胞疗 法的临床应用，现有技术中一般通过以下两个方面获得免疫细胞，一是直接从血液中提取 免疫细胞，二是考虑通过后期诱导分化扩增免疫细胞。 目前关于血液免疫细胞的分离和扩增方法不一，且大多步骤复杂，获得较多数量 血液免疫细胞也存在一定难度，在患者患病时采集血液也给患者造成二次伤害，并且减少 身体的免疫细胞，降低抵抗力，所以在健康时采集的血液如何高效简单的分离更多的免疫 细胞、保存和扩增成为免疫细胞治疗必须解决的问题，现有技术中已经存在从血液中分离 免疫细胞的方法，但是该类免疫细胞分离过程中，对于细胞在冻存过程中的保护有限，细胞 在冻存过程中容易受到损伤，在培养过程中的扩增数量也有十分有限。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供，通过保 存健康时的细胞，并在冻存过程中有效的保持细胞的活性，在扩增培养中能得到较高倍数 的扩增和较高纯度的细胞，从而增加了免疫细胞的得率。 本专利技术通过以下技术方案实现该目的： -种增加免疫细胞得率的方法，包括以下步骤： 1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比 为1:5~5:1; 2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的 加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为1:5~5:1，离心机400~ 1000g离心10~30min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞； 3)免疫细胞的冻存:将步骤2)收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬，向制得的细 胞悬液中加入细胞冻存液，摇匀分装至冻存管后移至程序降温仪，进行程序降温，降至-80 °C后，转移至液氮罐；所述细胞冻存液由茶多酚、人血白蛋白和DMS0组成，人血白蛋白与 DMS0的体积比为2~8:1; 4)免疫细胞的复苏:将步骤3)冻存的冻存管从液氮罐汇中取出，水浴溶解后将冻 存管中的细胞悬液转移至X-VIV015培养基中，细胞悬液与X-VIV015培养基的体积比为1:4 ~10,混匀后洗涤离心，将洗涤离心后的PBMC用X-VIV015培养基重悬，接种于培养瓶中； 5)免疫细胞的诱导扩增培养:对步骤4)的培养瓶中的细胞悬液进行诱导扩增培 养，在诱导扩增培养的过程中加入了海带多糖。 其中，步骤3)的细胞冻存液的配制方法:将茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的终 浓度为1~10mg/mL，按体积比人血白蛋白：DMS0 = 2~8:1，缓慢的加入DMS0，得到细胞冻存 液。 其中，步骤3)的冻存过程具体为:将步骤2)收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬， 再将上述细胞冻存液缓慢加入到细胞悬液中，细胞冻存液中人血白蛋白与DMS0的体积比为 5~17:1，茶多酸的终浓度为1~10mg/mL。 作为优选的，步骤3)的冻存管中免疫细胞的密度为2~6X106个/mL。 其中，步骤4)的冻存管从液氮罐汇中取出后，置于37°C恒温水浴，2min内完成溶 解，转移至X-VIV015培养基中，混匀后200~600g离心5~15min。 作为优选的，步骤4)的培养瓶中接种密度为1X106个/mL。 其中，NK细胞的诱导扩增培养方法： 6)向步骤4)的免疫细胞悬液中全量添加细胞生长因子IL-2JL-15JL-21、海带多 糖，其终浓度分别为 200 ~1000U/mL、200 ~1000U/mL、200 ~1000U/mL、15 ~120ug/mL，按总 体积5~20 %的量添加胎牛血清； 7)定期补充新鲜的X-VIV015培养基和11^-2、几-15、几-21、海带多糖、胎牛血清，使 得免疫细胞的密度不大于3X106个/mL; 8)连续培养12~16天。其中，CIK细胞的诱导扩增培养方法： 9)向步骤4)的免疫细胞悬液中全量添加细胞因子IFN-γ，使终浓度为200~ 10001]/11^，按总体积5~20%的量添加胎牛血清； 10)第二天全量添加细胞生长因子IL-2、海带多糖，使终浓度分别为200~1000U/ mL、15~120ug/mL; 11)定期补充新鲜的X-VIV015培养基和IL-2、胎牛血清，使得免疫细胞的密度不大 于3X106 个/mL; 12)连续培养12~16天。 相对于现有技术，本专利技术的有益效果为:本专利技术的增加免疫细胞得率的方法，包括 人外周血稀释、免疫细胞的分离、冻存、复苏及诱导扩增培养步骤，通过提取、保存健康时的 细胞，并在后期诱导扩增培养，大大提高了免疫细胞的得率，在冻存的过程中采用特有的细 胞冻存液可有效的保持免疫细胞的活性，在诱导扩增培养的过程中加入了海带多糖，能够 得到较高倍数的扩增和较高纯度的细胞，从而显著增加了免疫细胞的得率。【附图说明】图1为实施例9扩增培养后的NK细胞形态观察图。图2为对照例1扩增培养后的NK细胞形态观察图。图3为实施例12扩增培养后的CIK细胞形态观察图。图4为对照例2扩增培养后的CIK细胞形态观察图。图5为扩增培养后的NK细胞增殖曲线图。图6为扩增培养后的CIK细胞增殖曲线图。【具体实施方式】以下结合附图及具体实施例对本专利技术进行详细描述。实施例1、免疫细胞的分离 1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比 为 1:5; 2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的 加到Ficο11分离液上层，血液稀释液与Ficο11分离液的体积比为1: 5，离心机4 0 0g离心 30min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞。实施例2、免疫细胞的分离 1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比 为5山 2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的 加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为5:1，离心机700g离心 20min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞。实施例3、免疫细胞的分离 1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比 为 1:1; 2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的 加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为1:1，离心机1000g离心 10min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞。 实施例4、免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增加免疫细胞得率的方法，包括以下步骤：1)采集人外周血，用生理盐水稀释，制得血液稀释液，外周血与生理盐水的体积比为1：5～5：1；2)将Ficoll分离液加入sepmate离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为1：5～5：1，离心机400～1000g离心10～30min，分离外周血免疫细胞，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞；3)免疫细胞的冻存：将步骤2)收集的免疫细胞利用人血白蛋白重悬，向制得的细胞悬液中加入细胞冻存液，摇匀分装至冻存管后移至程序降温仪，进行程序降温，降至‑80℃后，转移至液氮罐；所述细胞冻存液由茶多酚、人血白蛋白和DMSO组成，人血白蛋白与DMSO的体积比为2～8：1；4)免疫细胞的复苏：将步骤3)冻存的冻存管从液氮罐汇中取出，水浴溶解后将冻存管中的细胞悬液转移至X‑VIVO15培养基中，细胞悬液与X‑VIVO15培养基的体积比为1：4～10，混匀后洗涤离心，将洗涤离心后的PBMC用X‑VIVO15培养基重悬，接种于培养瓶中；5)免疫细胞的诱导扩增培养：对步骤4)的培养瓶中的细胞悬液进行诱导扩增培养，在诱导扩增培养的过程中加入了海带多糖。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，陈海佳，葛啸虎，李丽娟，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44