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一种阳离子复合脂质纳米盘及其制备方法和用途技术

技术编号:15629293 阅读:253 留言:0更新日期:2017-06-14 13:27
本发明专利技术公开了一种新型阳离子复合脂质纳米盘及其制备方法和在基因转染中的应用。所述阳离子复合脂质纳米盘由含硅复合脂质、阳离子脂质、短链脂质和辅助脂质组成。所述阳离子复合脂质纳米盘基因复合物包含阳离子复合脂质纳米盘和基因工作液。本发明专利技术涉及的阳离子复合脂质纳米盘克服了其他载体毒性高、稳定性差和转染效率低的缺点,有效地提高了基因的转染效率。

【技术实现步骤摘要】
一种阳离子复合脂质纳米盘及其制备方法和用途专利技术人:戴志飞、梁子才、李妍妍、梁晓龙、吴一荻、郑书全、靳玉慎、刘仁发、赵云辉申请单位:北京大学
本专利技术属于生命医学领域,具体而言,本专利技术涉及一种阳离子复合脂质纳米盘及其制备方法和在基因转染中的应用。
技术介绍
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性诱导同源互补mRNA降解的现象。它由Dr.CragMcllo等于1998年最先在线虫中发现。2001年的研究成果表明,人工合成的小分子dsRNA(即smallinterferingRNA-siRNA,小分子干扰核糖核酸),在高等动物细胞中可发挥RNAi作用。这一研究成果在《SCIENCE》评选的2001年十大科技成果中位列第二。自此以后,RNAi这种最古老、最多功能的生物基因组防御系统,成为生命医学领域的焦点。RNAi在生物医药中主要应用领域包括:基因功能研究、疾病治疗,新药开发等诸多方面。在利用RNAi进行基因功能研究和基因治疗领域,介导RNAi的载体设计和构建,是其中的基础和关键技术,载体的选择对于利用siRNA介导的基因沉默实验来说是至关重要的,没有高效的转染,siRNA就不能有效的引发相应的细胞响应,会直接影响siRNA的抑制效果。常见的用于基因转染的载体主要包括病毒类载体和非病毒类载体;非病毒类载体主要包括基于脂质的载体、基于聚合物的载体和基于其他非病毒类物质的载体。这类载体有成本低、生物相容性好、毒性低、转染效率高以及免疫原性小等多种优势。市场现有的转染载体主要是为双链DNA转染设计的。随着RNAi技术越来越受重视,迫切需要广泛开发能够携载小核酸的载体。就目前而言,各厂家所推出的RNAi转染试剂,往往转染效率不高、毒性大、安全性低,极大地限制了其在医药领域的应用。因此亟需研发针对小核酸负电性、易被核酸酶降解、易被肾脏排出等特点的具备转染效率高、毒性低、安全性好的基因转染载体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于开展对核酸类药物载体的研究,寻找转染效率高、靶向性强、低毒、安全性好、制备工艺简单、无污染、产量高的核酸类药物载体。为达到以上目的,本专利技术采取以下措施,制备了一种阳离子复合脂质纳米盘,其与核酸类药物结合用于递送核酸类药物进入细胞实现基因转染的目的。该阳离子复合脂质纳米盘包括含硅复合脂质、阳离子脂质、短链脂质和辅助脂质等成分。本专利技术的阳离子复合脂质纳米盘中,含硅复合脂质具有如下结构:本专利技术的阳离子复合脂质纳米盘中,阳离子脂质具有如下结构的一种或几种:本专利技术的阳离子复合脂质纳米盘中,各成份的重量份数为:含硅复合脂质58.4-38.9份;阳离子脂质19.4-38.9份;和1,2-己酰基磷脂酰胆碱22.2份;优选地,各成份的重量份数为:含硅复合脂质38.9份;阳离子脂质38.9份;和1,2-己酰基磷脂酰胆碱22.2份;本专利技术阳离子复合脂质纳米盘的成份还可以包括辅助脂质,各成份的重量份数为:其中,辅助脂包括但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基卵磷脂、聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。本专利技术的阳离子复合脂质纳米盘的表面共价覆盖硅氧烷网络骨架。本专利技术的阳离子复合脂质纳米盘具有类似血红细胞的圆盘状结构。本专利技术的粒径范围为12nm-500nm。本专利技术提供了一种制备阳离子复合脂质纳米盘的方法,该方法包括下述步骤:(1)将含硅复合脂质在酸性乙醇溶液中水解,孵育30min后旋转蒸发去除乙醇;(2)将溶解有阳离子脂质、DHPC的氯仿溶液加入到步骤(1)的水解液中,均匀混合;或者将溶解有阳离子脂质、DHPC和聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的氯仿溶液加入到步骤(1)的水解液中,均匀混合;(3)使用旋转蒸发仪除去步骤(2)所得混合液中的溶剂,在真空下干燥过夜;(4)将水加入到步骤(3)所得到的固体薄膜中,在液氮中冻存30min后水浴超声溶解,液氮冻存后水浴超声溶解这一过程重复5个循环,最后用探头超声,即可得到所述阳离子复合脂质纳米盘。本专利技术方法中所述的,其中步骤(1)中的所述酸性乙醇溶液的pH为3.0,所述孵育是在40℃的温度下进行的。本专利技术方法中所述的,其中步骤(4)中的所述水浴超声的温度为55℃,所述水浴超声时间为20min,所述反复冻融的液氮冻存为10min,所述探头超声振幅为30%,所述探头超声进行5-10min。本专利技术提供了本专利技术的阳离子复合脂质纳米盘与siRNA结合在基因转染中的用途。本专利技术所述的阳离子复合脂质纳米盘的用途在于与核酸类药物结合后能够有效地将核酸类药物递送至细胞内达到基因转染的目的。本专利技术通过将含硅复合脂质和阳离子脂质与短链脂质通过冻融的方法,制备得到了具有较好稳定性的圆盘状结构的阳离子复合脂质纳米盘。在阳离子复合脂质纳米盘中引入具有共价连接的聚乙二醇分子的脂质会延长载体在体内的循环时间,从而能够在靶器官中更多的富集。本专利技术与现有技术相比,至少具有以下的优点:(1)本专利技术通过引入含硅复合脂质,从而在所得纳米盘的表面形成Si-O-Si网络结构,显著提高了阳离子复合脂质纳米盘的稳定性。(2)本专利技术的阳离子复合脂质纳米盘具有独特的类似血红细胞的圆盘状结构,能够有效携载核酸类药物进入细胞并从溶酶体中释放到细胞质中。(3)本专利技术的阳离子复合脂质纳米盘具有优良的生物相容性,其制备工艺简单、无污染、产量高、成本低且效率高。所得的阳离子复合脂质纳米盘相比于商品化脂质体能呈现出更好的基因转染效果,显示出广阔的应用前景。综上,这种阳离子复合脂质纳米盘系统有希望成为递送核酸类药物的载体,在不久的未来将发挥重要作用。附图说明本专利技术上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:附图说明图1为本专利技术所述阳离子复合脂质纳米盘的透射电子显微镜图,a为不含辅助脂质的阳离子复合脂质纳米盘,b为含有辅助脂质的阳离子复合脂质纳米盘。图2为阳离子复合脂质纳米盘原子力显微镜表征图;图3为不同含硅复合脂质和阳离子脂质掺杂比例制备的阳离子复合脂质纳米盘按照不同氮/磷比例与siRNA孵育后的琼脂糖凝胶电泳图;图4为本专利技术所述携载siRNA的阳离子复合脂质纳米盘在细胞中的分布情况;图5为携载siRNA的阳离子复合脂质纳米盘在人源肝癌细胞系HepG2-Luc细胞中的转染效果;图6为MTT法检测的携载siRNA的阳离子复合脂质纳米盘对人肝癌细胞系HepG2-Luc细胞的毒性结果;图7为携载siRNA的阳离子复合脂质纳米盘转染的人源肝癌细胞系HepG2-Luc细胞中Plk1mRNA实时定量PCR检测结果;图8为携载siRNA的阳离子复合脂质纳米盘通过尾静脉注入体内2h、12h、24h和48h后在小鼠体内的分布结果;具体实施方式下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明,以下各实施例仅用于说明本专利技术而不是限制本专利技术。I.阳离子复合脂质纳米盘的制备实施例1阳离子复合脂质纳米盘1的制备步骤:1)将含硅复合脂质在酸性乙醇溶液中水解,孵育30min后旋转蒸发去除乙醇;其中所述酸性乙醇溶液的pH值为3.0;酸性乙醇溶液的制备是通过将稀盐酸加入乙醇溶液中,用pH计调节到pH值为3.0。(2)将溶解有阳离子脂质、DH本文档来自技高网
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一种阳离子复合脂质纳米盘及其制备方法和用途

【技术保护点】
一种阳离子复合脂质纳米盘,其与基因结合用于基因转染,所述阳离子复合脂质纳米盘包括以下各成份:含硅复合脂质、阳离子脂质、短链脂质和辅助脂质。

【技术特征摘要】
1.一种阳离子复合脂质纳米盘,其与基因结合用于基因转染,所述阳离子复合脂质纳米盘包括以下各成份:含硅复合脂质、阳离子脂质、短链脂质和辅助脂质。2.根据权利要求1所述的阳离子复合脂质纳米盘,其中所述含硅复合脂质具有如下结构:3.根据权利要求1或2所述的阳离子复合脂质纳米盘,其中所述阳离子脂质包括但不限于以下结构中的一种或几种:4.根据权利要求1至3所述的阳离子复合脂质纳米盘,其中所述短链脂质包括但不限于1,2-己酰基磷脂酰胆碱(1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DHPC)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐{(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate),CHAPSO}。5.根据权利要求1至4所述的阳离子复合脂质纳米盘,其中所述的阳离子复合脂质纳米盘还包括辅助脂质成份,其中所述辅助脂质包括但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基卵磷脂、聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇200...

【专利技术属性】
技术研发人员:戴志飞梁晓龙刘仁发梁子才李妍妍吴一荻郑书全靳玉慎赵云辉
申请(专利权)人:北京大学
类型:发明
国别省市:北京,11

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