诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法技术

本发明专利技术公开一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，包括以下步骤：1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养；2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂；3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构；4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞；5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元；6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，属生物医学和发育生物领域。
技术介绍
大脑皮质是哺乳动物中枢神经系统最重要的组成部分，占大脑体积的3/4。大脑皮质包含上百种细胞类型组成的神经环路来执行感官知觉、运动、学习、语言等中枢神经系统的指令。大脑皮质损伤是造成神经退行性疾病如阿尔兹海默综合症、帕金森综合症的重要原因。hPSCs技术的出现，为体外模拟大脑皮质发育，构建退行性疾病模型以研究发病机制、分子机理、细胞筛药提供细胞模型。大脑皮质包含神经元主要分为两大种类，一类是兴奋性谷氨酰胺能经元，约占80％，另一类是抑制性γ-氨基丁酸能中间神经元(GABA interneurons)，约占20％。谷氨酰胺能神经元主要起源于胚胎前脑外套层室管膜前体细胞，随后放射性迁移到软脑膜。而GABA interneurons起源于内侧神经节隆起，然后沿切线方向迁移到大脑皮质。谷氨酰胺能神经元分泌谷氨酸递质，表达标记物glutamate、vGlut1。谷氨酰胺能神经元分布于大脑皮质I-VI层，位于不同皮质层的谷氨酰胺能神经元表达特定的转录因子。如第VI层表达Pax6、Tbr1；第V层表达Ctip2,Tbr2；第II-IV层表达Sabt2,Cux1,Brn2。谷氨酰胺能神经元还可投射到丘脑、基底核、中脑、后脑、脊髓等区域。大脑皮质谷氨酰胺能神经元在神经发育中扮演非常重要的角色。据文献报道，谷氨酰胺能神经元的异常与神经退行性疾病，如阿尔兹海默综合症，精神分裂症等密切相关。在神经病理学的研究中发现谷氨酰胺能神经元在精神分裂症患者的脑内表现出神经突数量减少，突触后蛋白PSD-95水平下降以及谷氨酸受体表达下降等缺陷。在阿尔兹海默患者的脑内，tau蛋白过磷酸化以及淀粉样蛋白质Aβ聚集主要发生在谷氨酰胺能神经元中，造成谷氨酰胺能神经元大量丢失，影响谷氨酰胺能神经系统的正常运行，导致阿尔兹海默患者认知功能出现障碍。在帕金森患者的皮层中，谷氨酸囊泡转运体vGlut1表达严重下调，谷氨酰胺能神经元丢失，谷氨酰胺能神经元活动减退。对于这些神经退行性疾病，目前多用药物治疗，但是此类疾病的根源在于神经元的异常或丢失，所以单纯用药物治疗的
效果不佳，用细胞替代治疗或许能从根本上治愈或者缓解神经退行性疾病。但是体外获得谷氨酰胺能神经元的数量特别有限，hPSCs体外诱导分化为特种神经元技术的兴起，为细胞移植治疗提供了巨大的潜力。hPSCs包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)。第一株hESCs是从早期胚胎的内细胞团中分离出来的，而hiPSCs则是Shinya Yamanaka用逆转录病毒将包含人Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc的四个因子转入人皮肤成纤维细胞后重编程后得到的。hiPSCs在形态、增殖、表面抗原、基因表达、端粒酶活性展现出了与hESCs非常相似的特性。hPSCs具有独特的性质，它们不但能进行自我更新，而且具有分化为三个胚层的能力。研究证明，在特定条件下hPSCs可以分化为任何一种细胞类型，如神经前体细胞，心肌细胞，肝细胞等。它们可作为一种再生资源治疗神经类疾病，如I型糖尿病，帕金森疾病，心血管疾病，肝脏疾病。hPSCs的出现，将为再生医学中应用细胞治疗提供不可估量的前景。越来越多的研究数据表明，hPSCs在特定的诱导坏境下可分化为大脑皮质谷氨酰胺能神经元。随着诱导技术的不断发展，尽管由hPSCs向谷氨酰胺能神经元的诱导分化已经取得一些突破，但仍然存在分化得到的神经元不纯等局限。据文献报道，hPSCs经过诱导分化，无法获得高纯度的大脑皮质谷氨酰胺能神经元，分化得到的细胞中还包含起源于侧神经节隆起的GABA投射神经元。可能是因为多能干细胞在分化的过程中自发分泌少量腹侧化因子SHH，诱导多能干细胞部分腹侧化。然而，在Pols One第6卷第9期e25788页发表的Anti-AβDrug Screening Platform Using Human iPS Cell-Derived Neurons for the Treatment of Alzheimer’s Disease一文中报道的实验显示，在培养中单纯加入SHH的抑制剂Cyclopamine，并不能够显著增加vesicular glutamate transporter的表达量，显示了谷氨酰胺能神经元数量并没有因为SHH抑制剂的加入而增加。在Neuron期刊2013年2月6日发表的Pyramidal Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells Integrate Efficiently into Mouse Brain Circuits In Vivo一文中同样显示加入Cyclopamine对于人神经前体细胞的命运-没有影响。由此可见，之前的实验均显示加入Cyclopamine并不能够得到高纯度的大脑皮质谷氨酰胺能神经元。因此，建立一种高效诱导hPSCs定向分化为谷氨酰胺能神经元的方法尤为重
要。理想状态下，通过分化获得的细胞不包含GABA能投射神经元，只包含谷氨酰胺能神经元。在本专利中，我们克服偏见，找到了一种高效分化hPSCs至大脑皮质谷氨酰胺能神经元的方法，为体外模拟大脑皮质发育，构建退行性疾病模型，研究发病机制、分子机理、细胞筛药提供细胞模型。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种诱导干细胞分化为谷氨酰胺能神经元的方法，具体涉及诱导hPSCs分化为大脑皮质谷氨酰胺能神经元的方法，更具体的涉及一种用神经诱导培养液NIM、腹侧化因子SHH抑制剂Cyclopamine将hPSCs诱导分化为大脑皮质谷氨酰胺能神经元的方法。该方法能有效解决大脑皮质谷氨酰胺能神经元纯度不高等缺陷造成的难题。本专利技术的进一步目的是提供所述方法制得的细胞在体外构建大脑皮质退行性疾病模型，为研究发病机制，分子机理，细胞筛药提供细胞模型。本专利技术的方法，将hPSCs经过贴壁，消化，悬浮，再贴壁，再悬浮等一系列诱导分化过程获得纯度较高的大脑皮质谷氨酰胺能神经元。具体是将hPSCs在神经诱导培养液中诱导后，加入腹侧化因子SHH抑制剂Cyclopamine，诱导hPSCs定向分化为谷氨酰胺能神经元。本专利技术方法中，首先将hPSCs在神经诱导培养液中进行分化，1天后加入腹侧化因子抑制剂Cyclopamine。该方法利用Cyclopamine抑制细胞分化过程中腹侧化因子SHH的分泌，能有效减少GABA投射神经元的产生，提高谷氨酰胺能神经元分化的纯度。具体而言，本专利技术的诱导hPSCs分化为大脑皮质谷氨酰胺能神经元的方法，诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将hPSCs细胞贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养；2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂；3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构；4)在分化第16天将形成的神本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养；2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂；3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构；4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞；5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元；6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元。

【技术特征摘要】
1.一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养；2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂；3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构；4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞；5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元；6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元。2.根据权利要求1所述的诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，其特征在于，所述步骤1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养具体为：将hPSCs贴壁培养于在室温下用基质胶Vitronectin提前2小时包被过的培养皿中；hPSCs所用培养液为Essential 8，由体积比为50:1的Essential 8TM Basal Medium DMEM/F12(Ham)(1:1)与Essential 8TM Supplement(50X)配制而成；hPSCs在培养皿中增殖为边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后，加入1ml Dispase(1Uml-1)于37℃，5％CO2的孵箱中孵育2分钟，移至显微镜下观察，克隆边缘发亮，并微微卷起时，将Dispase吸除；用DMEM/F12轻洗细胞，10-20s后吸走，再加入DMEM/F12轻轻将克隆吹下，一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至15ml离心管中；将装有细胞和DMEM/F12的离心管离心，800rpm,1min；吸除上清，将管底的细胞转移至细胞培养瓶，换上神经诱导培养液(Neural induction medium,NIM)，将细胞制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养，其中，神经诱导培养液NIM为DMEM/F12培养基，NEAA，N2以体积比98:1:1配制而成。3.根据权利要求1所述的诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，其特征在于，所述步骤2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂，具体为：分化第1天在神经诱导培养液中加入腹侧化因子SHH的抑制剂
\tCyclopamine，浓度为2-20μM，并且在分化第1-3天时加入体积为培液体积5％的血清替代物KOSR，分化第1天至分化第4天，每天半换液，4天之后，隔天半换液，更换的培养液均为加入Cyclopamine的神经诱导培养液，持续至分化第25天。4.根据权利要求1所述的诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，其特征在于，所述步骤3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构具体为：分化第7天时把拟胚体从培养瓶吸出置于离心管中，用头轻吹打2-3次；待细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘妍，曹诗颖，胡瑶，陈成，徐敏，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32