【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多胺的检测方法，具体涉及一种气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法。
技术介绍
1、多胺(典型代表包括腐胺、亚精胺和精胺)是一类含有两个或多个氨基的化合物，除生物体内源性合成外，食物是多胺的重要来源。膳食多胺对人类健康具有重要意义，尤其在生命早期阶段。新生儿和婴幼儿细胞生长快速，多胺的需求增加。母乳是提供新生儿多胺的第一个外源性重要来源。母乳中多胺的含量与新生儿、婴幼儿的健康密切相关。
2、尽管母乳中的多胺具有潜在的健康益处，但有关母乳和乳制品中多胺含量的报道却非常少见，重要原因之一是缺乏准确、灵敏的分析方法。多胺常用的检测方法有高效液相色谱法和气相色谱法，但由于定性能力及灵敏度的限制，二者目前多与质谱联用。此外，由于多胺的聚阳离子性质，样本处理方法多需使用酸基试剂和化学衍生。我国国家标准(gb5009.208-2016)中规定了丹磺酰氯衍生-液相色谱-紫外法测定食品中的生物胺，但适用的样品范围将乳制品排除在外。已报道母乳多胺含量的文献中多使用液相色谱-在线衍生-紫外/荧光法，但在线衍生化方法易受色谱条件的限制(包括衍生化试剂、反应时间和反应条件)，且紫外/荧光的定性和灵敏度不足。近期，zhanru yu(yu z,huang h,zhang h,kesslerbm.improved profiling of polyamines using two-dimensional gaschromatography mass spectrometry.talanta.2019,199:184-18
3、本专利技术基于三氟乙酸与多胺反应生成稳定、易挥发衍生化产物的特性，详细优化其在母乳及乳制品多胺检测中的最佳适用条件，并针对母乳及乳制品基质特点，进一步选择合适的固相萃取材料进行必要的净化处理，同时通过优选气相色谱毛细管柱及串联四级杆质谱参数，建立母乳及乳制品中多胺准确、灵敏的整套定量方法。
4、相较于当前母乳及乳制品中多胺的在线衍生化检测方法，本专利技术的衍生化反应时间和反应条件均不受色谱条件的限制，且衍生化后的样品能进一步净化和浓缩，同时结合串联质谱技术，检测的灵敏度及特异性大大提高；相较于液相色谱-质谱，本专利技术仪器设备价格较低，显著降低了样品检测成本。
技术实现思路
1、本专利技术基于气相色谱-串联质谱，建立准确、灵敏地定量母乳及乳制品中多胺的检测方法，方法非常适用于母乳及乳制品中多胺含量的研究。
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
3、一种气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，包括：取20～200μl母乳及乳制品，加入5～50μl同位素混合标准溶液，随后加入100～1000μl裂解液，充分涡旋，
4、离心，取上清液离心浓缩干燥，干燥后的样品在100～500μl乙酸乙酯和三氟乙酸酐混合液中重悬、40～80℃水浴中衍生化0.5～3小时，衍生化结束后继续离心浓缩干燥，二氯甲烷复溶后进行固相萃取净化，净化液氮吹至近干，加入20～200μl异丙醇和乙酸乙酯混合液复溶进行气相色谱-串联质谱检测；根据定性离子对和保留时间对多胺进行定性；将多胺定量子离子的峰面积与同位素内标定量子离子的峰面积的比值分别代入多胺的基质匹配内标标准曲线，获得多胺的浓度；
5、其中，气相色谱检测条件：色谱柱为db-35毛细管柱，规格为：柱长15～60m，内径0.18～0.32mm，膜厚0.14～0.32μm；进样量为1～3μl优选1～2μl，进样方式为不分流进样，进样口温度为200～400℃优选为200～300℃；色谱柱初始温度为60～150℃，保持1min，以6℃/min升至180℃，以15℃/min升至260℃，再以30℃/min升至325℃保持5min；
6、串联质谱检测条件：电子轰击电离源，70ev；离子源和传输线的温度均为300℃；检测模式为ms/ms检测模式。
7、优选的，所述多胺选自腐胺、亚精胺、精胺中的一种或多种。
8、优选的，所述同位素为氘代腐胺(腐胺-d4)和氘代精胺(精胺-d8)。
9、优选的，所述的同位素混合标准溶液为腐胺-d4和精胺-d8浓度均为6500nmol/dl的混合溶液。
10、优选的，母乳或乳制品取150μl，加入20μl同位素混合标准溶液，再加入150μl裂解液，其中裂解液为5％三氟乙酸、15％去离子水和80％甲醇组成的混合溶液。
11、优选的，所述的同位素为氘代腐胺(腐胺-d4)和氘代精胺(精胺-d8)；所述的同位素混合标准溶液为腐胺-d4和精胺-d8浓度均为6500nmol/dl的混合溶液。
12、优选的，所述的离心条件为：在温度4～40℃下、以转速5000～15000rpm/min离心5～30min。
13、更优选的，所述的离心条件为：4℃下以15000rpm/min离心20min。
14、优选的，上清液离心浓缩干燥温度为25℃。
15、更优选的，所述离心浓缩干燥条件为：以温度25℃、转速5000～15000rpm/min离心浓缩至近干。
16、优选的，所述的乙酸乙酯和三氟乙酸酐混合液为乙酸乙酯和三氟乙酸酐体积比1:2的溶液，加入量为300μl。
17、优选的，所述的水浴衍生化温度为60℃、衍生化时间为3小时。
18、优选的，所述的固相萃取净化条件为：2ml二氯甲烷复溶离心浓缩后的干燥管，固相萃取小柱填料为弗罗里硅土，规格为6ml/2g，净化过程为采用10ml二氯甲烷活化小柱，随后加入复溶液，接着用4ml二氯甲烷及4ml二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶液(二氯甲烷：乙酸乙酯＝8:2)淋洗小柱，最后加入10ml乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液。
19、优选的，所述的异丙醇和乙酸乙酯混合液为异丙醇和乙酸乙酯体积比1:9的溶液，加入量为50～100μl优选60μl。
20、优选的，所述的气相色谱检测条件：色谱柱为db-35毛细管柱，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm。
21、所述的气相色谱检测条件：进样量1μl，不分流进样，进样口温度300℃；色谱柱初始温度为80℃，保持1min，以6℃/min升至180℃，以15℃/min升至260℃，再以30℃/min升至325℃保持5min；质谱检测条件：电子轰击电离源，70ev；离子源和传输线的温度均为300℃。
22、更优选的，所述的质谱为串联四级杆质谱。
23、优选的，腐胺的定性离子对为167-70m/z和167-139m/z；亚精胺的定性离子对为364-251m/z和36本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：包括：取20～200μL母乳及乳制品，加入5～50μL同位素混合标准溶液，混匀，随后加入100～1000μL裂解液，充分混匀，离心，取上清液离心浓缩干燥，干燥后的样品重悬，然后在40～80℃水浴中衍生化0.5～3小时，衍生化结束后继续离心浓缩干燥，二氯甲烷复溶后进行固相萃取净化，净化液氮吹至近干，加入20～200μL异丙醇和乙酸乙酯混合液复溶进行气相色谱-串联质谱检测；根据定性离子对和保留时间对多胺进行定性；将多胺的定量子离子的峰面积与氘代同位素内标的定量子离子的峰面积的比值分别代入多胺的基质匹配内标标准曲线，获得多胺的浓度；
2.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：取150μL母乳或乳制品，加入20μL同位素混合溶液，再加入150μL裂解液，充分混匀，离心，取上清液进行离心浓缩干燥；
3.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的离心条件为：在温度4～40℃下、以转速5000～15000rpm/min
4.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的干燥后的样品在100～500μL乙酸乙酯和三氟乙酸酐混合液中重悬：
5.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的固相萃取净化条件为：2mL二氯甲烷复溶离心浓缩后的干燥管，固相萃取小柱填料为弗罗里硅土，规格为6mL/2g，净化过程为采用3～10mL二氯甲烷活化小柱，随后加入样品溶液，再用4～10mL二氯甲烷淋洗小柱及2～8mL二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶液淋洗小柱，最后加入6～12mL乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液；
6.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的异丙醇和乙酸乙酯混合液为异丙醇和乙酸乙酯体积比1:9的溶液，加入量为50～100μL。
7.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的气相色谱检测条件：色谱柱为DB-35毛细管柱，规格为：柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；进样量为1μL，进样方式为不分流进样，进样口温度为300℃；色谱柱初始温度为80℃，保持1min，以6℃/min升至180℃，以15℃/min升至260℃，再以30℃/min升至325℃保持5min。
8.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：腐胺的定性离子对为167-70m/z和167-139m/z；亚精胺的定性离子对为364-251m/z和364-154m/z；精胺的定性离子对为517-126m/z和517-154m/z；氘代腐胺的定性离子对为171-72m/z和171-141m/z；氘代精胺的定性离子对为525-126m/z和525-154m/z；
9.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的腐胺的保留时间为14.00～14.40min，亚精胺的保留时间为21.80～22.20min，精胺的保留时间为24.80～25.10min；腐胺-d4的保留时间为13.90～14.30min，精胺-d8的保留时间为24.80～25.10min；
10.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的多胺的基质匹配内标标准曲线是由以下方法绘制的：取150μL混合母乳或乳制品、20μL浓度为6500nmol/dL同位素混合标准溶液以及不同浓度的多胺混合标准溶液混合，再加入150μL裂解液，得到标准曲线溶液，混匀，离心，取上清液干燥后用乙酸乙酯和三氟乙酐混合液重悬，衍生化后再次真空离心浓缩干燥，2mL二氯甲烷复溶，随后进行固相萃取净化，净化液氮吹至近干，最后用异丙醇和乙酸乙酯混合液复溶，待气相色谱-串联质谱检测；以腐胺、亚精胺或精胺的浓度为横坐标，以腐胺、亚精胺或精胺的定量子离子的校正峰面积与氘代同位素内标的定量子离子的峰面积的比值为纵坐标，建立腐胺、亚精胺或精胺的基质匹配内标标准曲线；其中，所述的腐胺对应的同位素内标为氘代腐胺，亚精胺和精胺对应的同位素内标为氘代精胺；腐胺、亚精胺或精胺的定量子离子的校正峰面积为腐胺、亚精胺或精胺的定量子离子的峰面积减去基质本底中腐胺、亚精胺或精胺的定量子离子的峰面积；三种多胺的基质匹配内标标...
【技术特征摘要】
1.一种气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：包括：取20～200μl母乳及乳制品，加入5～50μl同位素混合标准溶液，混匀，随后加入100～1000μl裂解液，充分混匀，离心，取上清液离心浓缩干燥，干燥后的样品重悬，然后在40～80℃水浴中衍生化0.5～3小时，衍生化结束后继续离心浓缩干燥，二氯甲烷复溶后进行固相萃取净化，净化液氮吹至近干，加入20～200μl异丙醇和乙酸乙酯混合液复溶进行气相色谱-串联质谱检测；根据定性离子对和保留时间对多胺进行定性；将多胺的定量子离子的峰面积与氘代同位素内标的定量子离子的峰面积的比值分别代入多胺的基质匹配内标标准曲线，获得多胺的浓度；
2.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：取150μl母乳或乳制品，加入20μl同位素混合溶液，再加入150μl裂解液，充分混匀，离心，取上清液进行离心浓缩干燥；
3.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的离心条件为：在温度4～40℃下、以转速5000～15000rpm/min离心5～30min；优选的，所述的离心浓缩干燥条件为：以温度25℃、转速5000～15000rpm/min离心浓缩至近干。
4.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的干燥后的样品在100～500μl乙酸乙酯和三氟乙酸酐混合液中重悬：
5.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的固相萃取净化条件为：2ml二氯甲烷复溶离心浓缩后的干燥管，固相萃取小柱填料为弗罗里硅土，规格为6ml/2g，净化过程为采用3～10ml二氯甲烷活化小柱，随后加入样品溶液，再用4～10ml二氯甲烷淋洗小柱及2～8ml二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶液淋洗小柱，最后加入6～12ml乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液；
6.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的异丙醇和乙酸乙酯混合液为异丙醇和乙酸乙酯体积比1:9的溶液，加入量为50～100μl。
7.根据权利要求1所述的气相色谱-串联质谱测定母乳及乳制品中多胺的方法，其特征在于：所述的气相色谱检测条件：色谱柱为db-...
【专利技术属性】
技术研发人员：王丽，汪之顼，孙雅婷，董琳晶，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：
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