一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠皮层神经元的分离纯化和培养方法。本发明专利技术综合使用多种培养基从新生裸鼹鼠大脑皮层分离并纯化培养皮层神经元，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠皮层神经元的合理培养方法。本发明专利技术方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠皮层神经元，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠皮层神经元的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及细胞生物学
，具体涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠皮层神经元的分离纯化和培养方法。
技术介绍
：神经元虽然不是是哺乳动物中枢神经系统中比例最高的，但却是功能最重要的一类细胞，神经元在突触形成、突触信号传递，以及突触可塑性中发挥着至关重要的作用。而大脑皮层神经元在机体诸多功能，包括视觉、听觉、嗅觉、语言、运动、体表感觉等方面发挥着控制中枢的作用。裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度仅有6％左右的不通风洞穴中能够保持脑结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动。裸鼹鼠常年生活与地下黑暗狭窄的洞穴中，裸鼹鼠视觉功能严重退化，只能感受到无定形的光线信号，但无法接收清晰的图像信号，视觉中枢萎缩，远不及其他视力正常的啮齿类动物(MillsSL,CataniaKS(2004)Identificationofretinalneuronsinaregressiverodenteye(thenakedmole-rat).VisNeurosci21:107-117.；NikitinaN,Maughan-BrownB,RiainMO,KidsonS(2004)Postnataldevelopmentoftheeyeinthenakedmolerat(Heterocephalusglaber).AnatRecADiscovMolCellEvolBiol277:317-337.；HetlingJR,Baig-SilvaMS,ComerCM,etal.(2005)Featuresofvisualfunctioninthenakedmole-ratHeterocephalusglaber.JCompPhysiolANeuroetholSensNeuralBehavPhysiol191:317-330.)。听觉系统及听力也到了一定程度的削弱。首先外耳廓在进化过程中消失，在耳开口处只有由皮肤组成的环状结构。其次，其声源定位能力障碍，只能辨识以泥土为传播介质的低频声音(HeffnerRS,HeffnerHE(1993)Degeneratehearingandsoundlocalizationinnakedmole-rats(Heterocephalusglaber)withanoverviewofcentralauditorystructures.JCompNeurol331:418-433.)。另外其对空气中传播的气味分子的嗅觉能力严重受限。但是，裸鼹鼠其他功能则代偿性增强：其发达的终生保持增生能力且功能强大的切牙可以从事高强度的挖掘工作；在与其身体直径相当的洞穴中，裸鼹鼠主要依赖其体表数根触须发挥的触觉功能代偿其严重退化的视力和听力。这些生理功能的变化可能主要是其脑内对应脑区的形态结构和功能出现适应性的变化造成的(CataniaKC,RempleMS(2002)Somatosensorycortexdominatedbytherepresentationofteethinthenakedmole-ratbrain.ProcNatlAcadSciUSA99:5692-5697.；CrishSD,RiceFL,ParkTJ,ComerCM(2003)Somatosensoryorganizationandbehaviorinnakedmole-ratsI:vibrissa-likebodyhairscompriseasensoryarraythatmediatesorientationtotactilestimuli.BrainBehavEvol62:141-151.；ParkTJ,ComerC,CarolA,etal.(2003)Somatosensoryorganizationandbehaviorinnakedmole-rats:II.Peripheralstructures,innervation,andselectivelackofneuropeptidesassociatedwiththermoregulationandpain.JCompNeurol465:104-120.；HenryEC,RempleMS,O'RiainMJ,CataniaKC(2006)Organizationofsomatosensorycorticalareasinthenakedmole-rat(Heterocephalusglaber).JCompNeurol495:434-452.)。裸鼹鼠大脑皮层功能及其机制的阐明除了需要在体功能的研究，还需要对其特定大脑皮层神经元的研究，这就依赖于其大脑皮层纯化培养的神经元。目前，研究人员已经建立出大鼠及小鼠皮层神经元的培养方法(LinGang,Yu-chenYao,Ying-fuLiu,Yi-pengLi,KaiYang,LeiLu,Yuan-chiCheng,Xu-yiChen,andYueTu.Co-cultureofoligodendrocytesandneuronscanbeusedtoassessdrugsforaxonregenerationinthecentralnervoussystem.NeuralRegenRes.2015；10(10):1612–1616.)。中国专利申请CN201110164446.4，申请公布号为CN102839151A，公开了一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，所述的培养基为胰岛素－转铁蛋白－亚硒酸钠无血清培养基，其中含有0.5g/L胰岛素、0.5g/L转铁蛋白和0.5mg/L亚硒酸钠。中国专利申请CN201510072161.6，申请公布号为CN104611294A，公开了一种大鼠视皮层神经元体外培养方法，贴壁培养时先用接种培养基，18h后用维持培养基全换液；所述的接种培养基为DMEM/F12培养基中加入体积比为10％的马血清、2×105U/L的青链霉素和0.5mmol/L的L-谷氨酰氨；所述的维持培养基指NeurobasalMedium无血清培养基中加入体积比为2％的B27血清替代物和2×105U/L的青链霉素以及0.5mmol/L的L-谷氨酰氨。但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的皮层神经元分离纯化和培养方法均不适用于裸鼹鼠，目前国内外文献尚无有关裸鼹鼠皮层神经元分离纯化和培养方法的相关报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种裸鼹鼠皮层神经元的分离纯化和培养方法，以便捷、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠皮层神经元，为体外建立裸鼹鼠皮层神经元提供技术支持，同时为体外研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法，包括以下步骤：A、收集裸鼹鼠皮层混合神经细胞：分离65‑70天的胚胎裸鼹鼠大脑皮层组织，将大脑皮层组织剪碎，加入组织消化液混匀之后，于35‑37℃消化15‑30分钟；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养板中；B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养6‑10个小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2‑4天，然后将培养基更换为神经元维持培养基继续培养2‑4天，如此为一个循环，培养2‑4个循环；所述的神经元纯化培养基为含有10μM 5‑氟尿嘧啶的Nerobasal培养基并添加体积分数为2％的B27；所述的神经元维持培养基为含有体积百分数为2％B27的Neurobasal培养基，同时添加100ng/ml NGF；所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。

【技术特征摘要】
1.一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法，包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠皮层混合神经细胞：
分离65-70天的胚胎裸鼹鼠大脑皮层组织，将大脑皮层组织剪碎，加入
组织消化液混匀之后，于35-37℃消化15-30分钟；然后用混合神经细胞培
养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬
并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养
板中；
B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：
将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培
养箱中培养6-10个小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继
续培养2-4天，然后将培养基更换为神经元维持培养基继续培养2-4天，如
此为一个循环，培养2-4个循环；
所述的神经元纯化培养基为含有10μM5-氟尿嘧啶的Nerobasal培养
基并添加体积分数为2％的B27；
所述的神经元维持培养基为含有体积百分数为2％B27的Neurobasal培
养基，同时添加100ng/mlNGF；
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，
二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。
2.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔淑芳，杨文静，孙伟，汤球，肖邦，赵善民，丛薇，程继帅，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31