中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法技术方案

本发明专利技术公开一种中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法，中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型是在24孔培养板中有神经元细胞培养物及神经元细胞培养基，在神经元细胞培养基中插有TranswellInsert，所述TranswellInsert的滤膜内室面涂有胶原蛋白Ⅳ，在TranswellInsert的内室面有毛细血管内皮细胞培养物，在TranswellInsert的外室面有星形胶质细胞培养物，所述星形胶质细胞培养物的突起通过TranswellInsert的滤膜孔径穿向毛细血管内皮细胞培养物，所述神经元细胞培养基的组分及体积百分比如下：98%神经元细胞基础培养基、1%双抗、1%L-谷氨酰胺。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于中枢神经系统保护与损伤修复药物研究模型构建
，特别涉及一种基于中枢神经系统中毛细管内皮细胞(endothelial cells, E)、星形胶质细胞(astrocytes, A)及神经元细胞(neuron, N)三种基本细胞形成的。
技术介绍
中枢神经系统是世界上最重要、最复杂的生命组织，中枢神经系统疾病则是健康负担和医学难题之一，所以对于中枢神经系统保护与损伤修复药物研究一直是生物医药研究领域的热点和难点，其技术瓶颈即迫切需要建立一种既可以维持细胞在体内的正常形态及功能，又可以对其生长环境进行简单调节控制的细胞生长载体。在体内实验中，实验动物体内环境虽然能完整地保留细胞的各种 特征，但是过于复杂的体内环境和体内大量不可控因素以及动物之间的个体差异将导致相关的实验结果产生偏差，同时体内实验也很难实现对一种细胞进行基因组学、蛋白组学、代谢组学分析，这对以后的网络神经、精神药理学研究造成了很大的障碍。另外，通过外科手术获得的人脑与脊髓活体组织标本，其组织活性难以保证而且多为病理组织，无法满足深入研究(如药物靶点、药物效应、药物毒副作用、药代动力学等对比研究与评价)的需要，因此利用体外细胞培养方法进行神经保护与损伤修复药物研究已越来越受到广泛关注。毛细管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元细胞是中枢神经系统的三种基本细胞，三者关系非常密切，相互作用，相互影响。如不同的影响因子，其作用的靶细胞也不尽相同，有的可通过作用于神经元细胞发挥作用，有的作用于毛细血管内皮细胞或星形胶质细胞，有的在生理条件下则可能无法通过血脑屏障和血脊屏障。然而，目前该类研究相关的体外细胞培养方式主要为两大类:一类是对某一细胞单独培养，如单独培养神经元细胞，这种方法虽然避免了体内环境中大量不可控因素，但是过于简单的培养环境，往往导致所培养细胞丧失其体内的部分生物学特性，忽略了中枢神经系统中神经元细胞周围的其他两种重要细胞(毛细血管内皮细胞及星形胶质细胞)，无法满足关于中枢神经系统保护与损伤修复药物研究的全部需要。另一类为两细胞共培养，如神经元细胞与星形胶质原代细胞混合共培养以及利用Transwell系统将星形胶质细胞等与毛细血管内皮细胞共培养，借以研究血脑屏障和血脊屏障。此种方法只侧重研究了中枢神经系统中星形胶质细胞与毛细血管内皮细胞或神经元细胞的相互作用，也忽略了毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元细胞三者相互作用的系统关系。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种基于中枢神经系统中毛细管内皮细胞(endothelial cells, E)、星形胶质细胞(astrocytes, A)及神经元细胞(neuron, N)三种基本细胞形成的。本专利技术的技术解决方案是:一种中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型，在24孔培养板中有神经元细胞培养物及神经元细胞培养基，在神经元细胞培养基中插有Transwell Insert,所述TranswelI Insert的滤膜内室面涂有胶原蛋白IV，在TranswellInsert的内室面有毛细血管内皮细胞培养物,在Transwell Insert的外室面有星形胶质细胞培养物，所述星形胶质细胞培养物的突起通过Transwell Insert的滤膜孔径穿向毛细血管内皮细胞培养物，所述神经元细胞培养基的组分及体积百分比如下:98%神经元细胞基础培养基、1%双抗、1% L-谷氨酰胺。一种上述中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型的构建方法，其特征在于按如下步骤进行: a.分别提取同一种属同一部位的星形胶质细胞、毛细血管内皮细胞及神经元细胞并分别进行原代培养； b.在TranswellInsert滤膜内室面涂胶原蛋白IV,备用； c.先用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化原代培养9天的星形胶质细胞，用星形胶质细胞完全培养基重悬至密度为I X IO5个/ml,取100 μ I种植于的Transwell Insert的外室面，倒置于无菌容器中，放入37°C，5% CO2培养箱培养至细胞贴壁，然后将TranswellInsert正置于24孔培养板中，外室与内室都加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，放入37°C, 5% CO2培养箱内继续培养，倒置培养及正置培养共2天；其次用质量浓度为0.05%的胰蛋白酶消化原代培养5天的毛细血管内皮细胞，用毛细血管内皮细胞完全培养基重悬至密度为IXlO5个/ml，吸出Transwell Insert内室中DMEM培养基，取200 μ I毛细血管内皮细胞悬液种植于已生长有大脑皮质星形胶质细胞的TranswelI Insert的内室面,然后再将Transwell Insert正置于24孔培养板中，放入37°C，5% CO2培养箱内继续培养2天；最后将在24孔培养板中原代培养 6天的神经元细胞的完全培养基更换为所述神经元细胞培养基，再将培养有毛细血管内皮细胞与星形胶质细胞的Tanswell Insert插入神经元细胞培养基中，放入37°C，5% CO2培养箱内培养I天。本专利技术是按照体内中枢神经系统毛细血管内皮细胞(endothelial cells, E)、星形胶质细胞(astrocytes, A)及神经元细胞(neuron, N)的相对空间结构，首次利用Transwell将来源于同一种属动物(包括大鼠、小鼠及人等各种高级动物)同一部位的三种原代细胞进行立体共培养，构建原代同源EAN三细胞四维模型。本专利技术所采用的细胞来源于同一种属同一部位，避免了不同种属细胞来源所造成的差异性；本专利技术运用原代细胞进行共培养，比细胞系更直接来源于机体组织，生物性状尚未发生大的变化，在一定程度上更能够准确反映体内的状态；本专利技术最大限度地保留了三种基本细胞在体内的整体关联特性，可作为药物靶点(疾病靶点、细胞靶点、分子靶点及其作用机制)、药物效应、药物毒副作用、药代动力学等对比研究与评价的新细胞模型。附图说明图1为本专利技术实施例EAN三细胞四维模型构造示意图。图2为本专利技术实施例EAN三细胞四维模型构建方法示意图。图3为单独培养大脑皮质毛细血管内皮细胞免疫荧光染色图。图4为本专利技术实施例共培养的大脑皮质毛细血管内皮细胞免疫荧光染色图。图5为单独培养与本专利技术实施例共培养大脑皮质毛细血管内皮细胞的阳性结构长短轴比值示意图。图6为单独培养大脑皮质星形胶质细胞免疫荧光染色图。图7为本专利技术实施例共培养的大脑皮质星形胶质细胞免疫荧光染色图。图8为单独培养与本专利技术实施例共培养大脑皮质星形胶质细胞的中心聚集面积比值示意图。图9为单独培养与本专利技术实施例共培养大脑皮质星形胶质细胞的周围投射面积比值示意图。图10为单独培养大脑皮质神经元细胞免疫荧光染色图。图11为本专利技术实施例共培养的大脑皮质神经元细胞免疫荧光染色图。图12为单独培养与本专利技术实施例共培养大脑皮质神经元细胞的阳性结构长度示意图。图13为本专利技术实施例EAN三细胞四维模型激光共聚焦3D重建后扫描图。具体实施例方式本专利技术的中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型的构建方法，是按如下步骤进行: a.分别提取SD大鼠大脑皮质的星形胶质细胞、毛细血管内皮细胞及神经元细胞并分别进行原代培养； 具体操作如下: al本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型，其特征在于：在24孔培养板（1）中有神经元细胞培养物（2）及神经元细胞培养基（3），在神经元细胞培养基（3）中插有Transwell?Insert（4），所述Transwell?Insert（4）的滤膜内室面涂有胶原蛋白Ⅳ（5），在Transwell?Insert（4）的内室面有毛细血管内皮细胞培养物（6），在Transwell?Insert（4）的外室面有星形胶质细胞培养物（7），所述星形胶质细胞培养物（7）的突起通过Transwell?Insert（4）的滤膜孔径（8）穿向毛细血管内皮细胞培养物（6），所述神经元细胞培养基（3）的组分及体积百分比如下：98%?神经元细胞基础培养基、1%?双抗、1%?L?谷氨酰胺。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙长凯，李彧媛，郑铁铮，范明，赵慧，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：