本发明专利技术涉及一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点激活水平的ELISA试剂盒，能在来自E17胚胎的大鼠原代皮层神经元细胞中定量检测内源性TrkB受体受到其同亲配体BDNF刺激后的激活水平。BDNF能诱导TrkB受体胞内段多个酪氨酸残基发生磷酸化，该诱导具有时间依赖性和剂量依赖性。这一过程可在TrkB受体固定在包被后的96孔板后使用第816位氨基酸磷酸化的TrkB（在人源为第817位）抗体以及磷酸化的酪氨酸抗体（抗PY99泛用抗体）检测。因此，本发明专利技术为在原代神经元培养物和脑组织中定量检测内源性TrkB受体的激活水平提供了一个强大的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学生物
，涉及一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点活性的ELISA试剂盒及其使用方法。
技术介绍
脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族的成员，该家族包括神经生长因子(NGF)，NT-3, NT-4/5(Thoenen, 1991)。BDNF,如同其他神经营养因子，具有通过TrkB受体酪氨酸激酶通路影响神经元细胞的生物学活性(Huang et al. , 2008;Kaplan andMiller, 2000)。TrkB是脑中分布最广泛的神经营养因子之一，且在大脑皮层，海马，纹状体，脑干中高度富集(Shelton et al.，1995)。BDNF结合到TrkB能触发后者的二聚化，这一过程是通过顺应性改变和酪氨酸残基的自磷酸化实现的，其结果将导致包括促分裂素原活化 蛋白激酶(MAPK)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷脂酶C-gl (PLC-gl)在内的三条主要信号通路的激活。BDNF/TrkB信号通路在许多细胞过程如突触可塑性和神经保护作用中扮演了关键性角色(Hennigan et al. , 2007;Nagappan and Lu, 2005)。例如,BDNF能保护海马免受谷氨酸中毒且能拯救小脑神经元细胞的细胞程序性死亡(Leeds et al.，2005)。BDNF对参与多种神经变性性疾病的神经细胞，如参与外周感觉病变的感觉神经元(Lindsay，1996)，在帕金森氏病中缺失的黑质多巴胺能神经元及参与阿尔兹海默症的基底前脑胆碱能神经元(Siegel and Chauhan, 2000),都具有神经营养作用，故而已经成为治疗领域研究热点之一。最近，越来越多的证据表明这些分子也参与到神经发生和抗抑郁药物作用过程。抗抑郁药物能诱导BDNF信使RNA (mRNA)的表达，以及TrkB的自磷酸化激活过程(Nibuya etal. , 1995; Saarelainen et al. , 2003),在小鼠强迫游泳实验中，抗抑郁药物对BDNF单等位基因激活小鼠(BDNF+/mice)，前脑BDNF特异性完全缺失小鼠，及表达显性失活TrkB(trkB.Tl)小鼠的作用药效降低(Monteggia et al. , 2004; Saarelainen et al.，2003)。因此，BDNF/TrkB在多种神经学过程都扮演了重要角色。Trk受体的激活导致在该受体胞内段10个进化保守的酪氨酸残基中的若干发生磷酸化。其中3个(在人类是第670、674、675位酪氨酸)位于激酶结构域的激活环。这些残基的磷酸化可以增强酪氨酸激酶的活性，这种增强是通过将这些带负电荷的磷酸化酪氨酸残基与其附近的碱性氨基酸残基配对而实现的。更多的磷酸化酪氨酸可以提供能与含有多聚嘧啶串结合蛋白(PTB)结构域或肉瘤病毒编码蛋白同源结构域2型(SH2)的蛋白结合的停泊位点。细胞内信号转导事件能够被这些受体蛋白激活，包括大鼠肉瘤蛋白(Ras)-快速生长纤维瘤蛋白(Raf) -MAPK，PI3K-Akt，磷脂酶C (PLC)-y-钙离子(Ca2+)，核转录因子(NFkB),以及非典型蛋白激酶C信号通路。当前研究已经关注于一对磷酸化酪氨酸之间的相互作用。第490位和785位的酪氨酸是不在激酶激活结构域内的主要的磷酸化酪氨酸(Stephens et al. , 1994)。TrkA和TrkB的磷酸化位点都是各自对应保守的TrkA第490位酪氨酸对应TrkB第512位酪氨酸，TrkA第674/675位酪氨酸对应TrkB第706/707位酪氨酸，TrkA第785位酪氨酸对应第817位酪氨酸(人源，在小鼠是第816位)(Huang andReichardt, 2003)。目前检测这些信号通路激活的方法中，各种针对TrkB受体特定磷酸化位点的抗体的免疫印迹法已经被广泛应用。尽管定量ELISA检测磷酸化的TrkB的试剂盒已经可以商业化购买，但是目前尚只有针对人源TrkB受体的产品。TrkB受体在许多肿瘤组织中高度表达，如神经母细胞瘤，前列腺癌和胰腺导管腺癌。在神经母细胞瘤中，当促肿瘤生存的自分泌循环信号通路被过度表达的BDNF所增强时，TrkB的高度表达与不利病情转归的出现息息相关。因此，这些方法还可以应用于检测人癌细胞中TrkB的激活。不过，BDNF/TrkB信号通路主要还是在神经系统中扮演角色，内源性的TrkB受体也处在一个本底水平。所以研究上还是以大鼠或小鼠作为主要实验对象。然而赛尔新罗公司(Cell Signaling)的ELISA产品并不能满足这种需要。故而，我们建立了一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点激活水平的ELISA试剂盒，可以检测出大鼠内源性TrkB的激活。考虑到不同物种蛋白存在同源性，该试剂盒可应用于人，小鼠和大鼠。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点活 性的ELISA试剂盒。本专利技术的ELISA试剂盒包括以下组成第817位磷酸化的TrkB抗体包被的96孔板；PY-99 抗体，以 1:1000 稀释于 2%BSA/PBST 溶液；辣根过氧化物酶体标记的抗鼠IgG 二抗，1:5000稀释于2%BSA/PBST溶液。还包括TMB底物溶液，其为将Img TMB溶解于ImL 二甲基亚砜DMSO中，而后加入新鲜配制的9mL pH5. O的柠檬酸盐缓冲液中，最后加入100 μ I 3%双氧水H2O2 ； STOP终止溶液，成分为3N HCL ；洗脱缓冲液，其稀释20倍后的终溶液为PBST溶液；样品稀释液，为2%BSA/PBST溶液加入2mM钒酸钠；细胞裂解缓冲液，成分为IOOmM β甘油磷酸钠，500mM Tris-盐酸(pH 7. 4)，I. 5M氯化钠，IOmM 乙二胺四乙酸二钠 EDTA (pH 8. O)，10%Triton X-100, 20mM 钒酸钠，500mM 氟化钠，IOOmM焦磷酸钠，1:10加入西格玛公司出品的蛋白酶抑制剂混合物，稀释10倍后使用。本专利技术的ELISA试剂盒使用方法如下将第817位磷酸化的TrkB抗体包被到96孔板中4摄氏度过夜，洗涤。包被后的平板使用2%牛血清白蛋白(BSA)封闭，充分洗涤后孵育以40 μ g溶解于样品稀释液中的细胞蛋白，这些细胞来自于经BDNF(100ng/ml)处理15分钟的细胞培养物。平板在4摄氏度下缓速摇过夜，而后再次充分洗涤。接下来用抗PY99孵育平板，4摄氏度过夜。第2天洗涤平板后，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠二抗。用TMB作为底物检测信号，因为TMB可被氧化为蓝色溶液。颜色强度和显色时间随检测的灵敏度和检测条件不同而改变。当反应到达合适的颜色强度时，加入酸性的STOP终止溶液终止反应，溶液颜色将由蓝色变为黄色。反应终止后一个小时内检测结果可以维持稳定，平板应及时在450nm下用读板器分析结果。此外，我们还检测了在650nm的吸光度，这个数值代表平板和溶液本身的本底干扰，故而要用450nm的吸光度减去650nm的吸光度。本专利技术的ELISA试剂盒及ELISA方法，能定量分析TrkB在原代神经培养物中被激活的水平。我们验证了 ELISA实验的结果同使用磷酸化TrkB抗体进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点活性的ELISA试剂盒，其特征在于，包括以下组成：第817位磷酸化的TrkB抗体包被的96孔板；PY？99抗体，以1:1000稀释于2%BSA/PBST溶液；辣根过氧化物酶体标记的抗鼠IgG二抗，1:5000稀释于2%BSA/PBST溶液。
【技术特征摘要】
1.一种检测TrkB受体816/817位酪氨酸位点活性的ELISA试剂盒，其特征在于，包括以下组成 第817位磷酸化的TrkB抗体包被的96孔板； PY-99抗体，以1:1000稀释于2%BSA/PBST溶液； 辣根过氧化物酶体标记的抗鼠IgG 二抗，1:5000稀释于2%BSA/PBST溶液。2.根据权利要求I所述的ELISA试剂盒，其特征在于，还包括 TMB底物溶液，其为将Img TMB溶解于ImL 二甲基亚砜DMSO中，而后加入新鲜配制的9mL pH5. O的柠檬酸盐缓冲液中，最后加入100 μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶克强，
申请(专利权)人：武汉远征世纪制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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