一种牛奶中人乳铁蛋白筛查试纸条及制备方法技术

本发明专利技术属于转基因成分检测技术领域，与免疫胶体金技术有关。公开了一种用于快速检测转人乳铁蛋白(hLF)基因牛奶的免疫胶体金试纸条及其制备方法，本发明专利技术的试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，其特征在于，在PVC背衬上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有所述的抗hLF多克隆抗体-胶体金标记物，该多克隆抗体通过人工合成hLF多肽后免疫家兔而制得。所述的硝酸纤维素膜上分别包被有hLF蛋白构成的检测线(5)和山羊抗兔IgG的质控线(6)。本发明专利技术的试纸条特异性强，操作简便，检测快速。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于牛奶转基因成分的检测
，与免疫胶体金检测技术有关。具体涉及一种转人乳铁蛋白(human lactoferrin,简称hLF)基因成分的快速简便的免疫胶体金检测试纸条及其制备方法。
技术介绍
转基因动物及转基因动物产品以其诱人的经济前景，显示出强大的生命力，其市场化将是不可扭转的时代趋势。然而，鉴于生物安全问题，转基因动物生产的各个环节都需受到严格的控制。因此，一套健全、科学、规范的安全评价体系是必不可少的。其中，可靠、准确的转基因检测方法是安全评价体系中的重要环节。中国农业大学的李宁教授已经成功培育出了一批转人乳铁蛋白转基因奶牛，数量 达到了产业化规模。这标志着我国转基因奶牛新品种培育和动物乳腺生物反应器技术达到了国际先进水平，鉴于转人乳铁蛋白基因奶牛生产技术的成熟以及其产品市场化的趋势，建立一种快速、简便的检测人乳铁蛋白的方法，有很重要的必要性和紧迫性。目前对于转基因成分的检测可从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行，从蛋白质水平进行转基因成分检测，具有必要性和可行性，这是因为只有对目的蛋白质进行检测，才能反映外源基因的最终表达情况；对于生物反应器制得的蛋白产品，必须对蛋白质进行定性、定量以及生物活性分析；对蛋白质进行检测，蛋白质样品制样较核酸简单。诸多的蛋白质检测方法，大致可以分为4类(1)基于蛋白质的物理化学特性的检测，如双向电泳、质谱、色谱等；(2)基于核酸与蛋白质之间的互作的检测，如邻位连接技术，是一种依赖于适配子(aptamer，能够特异地识别并结合蛋白质的DNA或RNA的总称)的检测技术(Mats G. , Simon F. , Michael T. , et al.A sense of closeness protein detectionby proximity ligation · Current Opinion in Biotechnology, 2003,14 :82-86 ;SimonF. , Mats G. , Jonas J. , et al. Protein detection using proximity-dependent DNAligation assays . Nature, 2002, 20 :473-477) ； (3)基于蛋白质与蛋白质之间的互作的检测，如常用的免疫检测方法，包括western blot, dot blot (不需专门的仪器,但是操作繁琐，不适合做批量检测)，ELISA(灵敏度高、特异性强、简单快速、稳定性好、便于自动化检测等特点，应用性强)，以及免疫组织化学染色法(具有特异性强、灵敏度高、定位准确的特点，便于进行功能研究，但是操作复杂、假阳性率高)等；(4)将对蛋白质的检测转化为核酸的检测，如 Bio-bar code assay,灵敏度高(Khan S, Klein ff, Mirkin CA, etal.Fluorescent and scanometric ultrasensitive detection technologies with thebio-bar code assay for alzheimer，s disease . Nanoscape, 2005, 2 (I) :7_15)。上述提到的这些方法都比较费时费力，而且需要专业技术人员和专门的仪器设备，基本上只能在实验室完成，不便于基层推广。胶体金免疫层析(gold-immunochromatographyassay GI CA)是 20 世纪 80 年代发展起来的一项新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。依据胶体金免疫层析技术，在转基因植物检测中，已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测试纸条。鉴于转基因动物及其产品的应用前景，研发快速、灵敏、准确、安全、便捷的转基因动物及其产品的检测方法，为转基因动物安全评价及转基因动物的监测和监控提供技术支撑，对于转基因动物及其产品的安全管理具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对转基因动物蛋白质检测体系缺乏的现状，建立一种适用于牛奶中转人转人乳铁蛋白(hLF)的快速检测试纸条及其制备方法。本专利技术能准确快速检测出转基因牛奶中转人乳铁蛋白(hLF)，不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本专利技术的方法同时也为转基因动物及其产品安全评价和管理提供借鉴。 本专利技术的总体技术路线图见图I所示。本专利技术的技术方案如下一种检测牛奶中人乳铁蛋白(hLF)的免疫胶体金筛查试纸条，其包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬。在PVC背衬I上依次搭接粘帖的样品垫3、结合垫4、硝酸纤维素膜2及吸水纸7 ;所述的结合垫4上包被有兔抗人乳铁蛋白多克隆抗体；所述的硝酸纤维素膜2上分别包被有人乳铁蛋白的检测线5和山羊抗兔IgG的质控线6 ；上述人乳铁蛋白(hLF)购自Sigma公司，货号L4894 ;山羊抗兔IgG购自Millipore 公司，货号IE0035 ；所述的兔抗人乳铁蛋白多克隆抗体是通过如下步骤制备得到的(I)对人乳铁蛋白(hLF)蛋白进行分析，选择亲水性好、处于分子表面、柔韧性好且与牛乳铁蛋白同源性低的区段，人工合成一段抗原多肽，其蛋白质序列如序列表SEQ IDNO 2所示；(2)将步骤⑴所示的多肽交联到载体蛋白匙孔血蓝蛋白(简称KLH)上，得到复合蛋白，再将该复合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，取得阳性血清后经亲和纯化制得兔抗人乳铁蛋白多克隆抗体。申请人:提供了一种人乳铁蛋白蛋白筛查试纸条的制备方法，其包括如下步骤(I)用柠檬酸钠与氯金酸反应制备胶体金；(2)将制备的抗hLF多克隆抗体加入步骤I制备的胶体金中，得到抗人乳铁蛋白多克隆抗体-胶体金标记物；(3)将抗人乳铁蛋白多克隆抗体-胶体金标记物包被到结合垫4上；(4)将人乳铁蛋白蛋白标准品包被到硝酸纤维素膜2上构成检测线5 ;并将山羊抗兔IgG包被到硝酸纤维素膜2上构成质控线6 ；(5)在所述的PVC背衬I上依次搭接粘帖的样品垫3、结合垫4、硝酸纤维素膜2及吸水纸7，得到所述的检测牛奶中人乳铁蛋白的免疫胶体金试纸条。本检测试纸条结构如图2所示。本专利技术的试纸条是由样品垫3、结合垫4、硝酸纤维素膜2、吸水垫7按图示的顺序依次粘附在PVC背衬I上组装而成的。结合垫上包被有本专利技术制备的抗hLF多克隆抗体一胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有检测线5和质控线6，其中检测线为购买的hLF蛋白标准品，质控线为购买的山羊抗兔IgG。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC背衬均购自Millipore公司。本专利技术试纸条检测原理检测牛奶时，将其滴加到样品垫上，通过毛细作用牛奶就会向吸水垫一端渗透，当溶液经过金标垫时其中的人乳铁蛋白就会与有色颗粒标记的兔抗人乳铁蛋白多克隆抗体反应，形成抗原-抗体复合物，使得样品中的人乳铁蛋白间接地被有色颗粒标记。此复合物继续向吸水纸一端流动，经过检测线时，由于有色颗粒标记的抗体已经与样品中的hLF结合，便失去了与检测线处包被的人乳铁蛋白结合的能力，因此就不会出现红色的检测线；溶液继续向前流动，到达质控线时，有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛奶中人乳铁蛋白免疫胶体金筛查试纸条，其包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，其特征在于，在PVC背衬(1)上依次搭接粘帖样品垫(3)、结合垫(4)、硝酸纤维素膜(2)及吸水纸(7)；所述的结合垫(4)上包被有兔抗人乳铁蛋白多克隆抗体；所述的硝酸纤维素膜(2)上分别包被有人乳铁蛋白的检测线(5)和山羊抗兔IgG的质控线(6))；所述的兔抗人乳铁蛋白多克隆抗体是通过如下步骤制备得到的：(1)对人乳铁蛋白进行分析，选择亲水性好、处于分子表面、柔韧性好且与牛乳铁蛋白同源性低的区段，人工合成一段抗原多肽，其蛋白质序列如序列表SEQ？ID？NO：2所示；(2)将步骤(1)所示的多肽交联到载体蛋白匙孔血蓝蛋白上，得到复合蛋白，以该复合蛋白为抗原，通过免疫获得阳性血清，经亲和纯化后制备得到兔抗人乳铁蛋白多克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘榜，刘楚新，翟珊莉，张庆德，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：