本发明专利技术涉及一种用磷光二氧化硅纳米颗粒标记的西马特罗免疫层析试纸条及其制备方法。试纸条含有支撑层、吸附层和保护层，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、磷光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联西马特罗的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；磷光抗体纤维层采用吸附磷光抗体的玻璃纤维棉制成，磷光抗体采用磷光二氧化硅纳米颗粒标记的西马特罗抗体。本发明专利技术的试纸条特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，可进行定量和定性检测，最低可检测到匹克级的痕量残留，适用范围广，成本低，易于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种免疫层析试纸，特别是涉及一种用磷光二氧化硅纳米颗粒为标记的用于定量检测西马特罗的免疫层析试纸条及制备方法。
技术介绍
西马特罗(cimaterol, CIM)又名喜马特罗,塞曼特罗,属于苯こ胺类药物的ー种，是ー种强效β 2-受体激动剂。CM在医学和兽医临床上主要用于扩张气管和増加肺通气量，可以用于哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痉挛和休克等症。研究显示，饲喂CIM可以增加肥育猪的饲料报酬并增加瘦肉率，对牛、鸡、鸭和绵羊等动物都有一定作用，故CIM常被作为饲料添加剂非法用于动物源性食品生产中。长期使用则可能造成CIM在可食动物组织内蓄积性残留，常常引起食用者发生心悸、肌肉震颤、疼痛、神经症状、头晕头痛、恶心呕吐、发热寒战等临床症状，特别对心脏病、糖尿病和高血压等病人危害更大。鉴于CIM的明显危害，我 国禁止CM在畜禽生产中应用，并规定在所有的动物可食组织中不得检出。目前，用于西马特罗残留检测的方法较多，如(I)理化分析方法，如高压液相色谱法、气相色谱法、薄层层析法、电泳法等；(2)免疫分析法，如放射免疫法、酶联免疫吸附法等；(3)生物測定法，如微生物学測定法、放射受体测定法等。这些方法需要昂贵的仪器设备，需要熟练的专业人员操作，过程复杂，时间较长，限制了其应用范围，难以在生产中推广应用。免疫分析标记技术是指以抗原抗体间的特异性反应为基础，通过标记物对某种物质进行定性或定量检测的研究。标记免疫分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记，这种标记物保持了抗体或抗原的活性，不影响标记物的活性，当它与相应抗体或抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用，可以提高免疫分析的敏感性。荧光免疫分析是以荧光素、荧光染料、量子点、镧系元素等为标记物，将抗原或抗体标记以突光物质与相应的抗原或抗体结合,在突光显微镜下检测突光强度的一种检测方法。该法具有灵敏度高、特异性强的特点，但某些荧光素会产生生物学毒性，导致抗原或抗体的灵敏度和选择性下降。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题提供一种用磷光二氧化硅纳米颗粒为标记的检测西马特罗免疫层析试纸条及其制备方法，该试纸条具有特异、灵敏、快速、简便定量检测微量西马特罗的特点。本专利技术的技术方案ー种磷光二氧化硅纳米颗粒标记的检测西马特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、磷光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联西马特罗的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述磷光抗体纤维层采用吸附磷光抗体的玻璃纤维棉制成，磷光抗体采用磷光二氧化娃纳米颗粒标记的西马特罗抗体。所述磷光二氧化硅纳米颗粒的粒径为100_220nm。所述磷光二氧化硅纳米颗粒标记的西马特罗抗体由以下方法制备，具体步骤为 (O磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化将Ig磷光二氧化硅纳米颗粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;回流液冷却后6500rpm离心5-10min，将得到的沉淀用无水こ醇洗涤，再将沉淀分散在无水こ醇中； (2)西马特罗抗体的标记将西马特罗抗体置于2-8°C、浓度O. 025-0. 05mol/L、pH9. 5的CBS缓冲液中透析8_12h ;将氨基化的磷光二氧化硅纳米颗粒10000-13000rpm离心4_8min,用所述CBS缓冲液洗漆，然后与透析的西马特罗抗体混合均匀，于2-8°C反应，过夜，得到磷光二氧化硅的抗体复合物；向所得的抗体复合物中按I :50-120的体积比加入O. 5mol/L的氰基硼氢化钠溶液，混匀，2_8°C反应8_12h ;用质量浓度2%的BSA溶液封闭过夜，10000-13000rpm离心4_8min，得沉淀；将沉淀用O. 5mL、浓度O.01-0. 02mol/L、pH7. 8 的 Tris-HCL 缓冲液洗涤后，4°C保存，备用。所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜； 偶联西马特罗的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述隐形检测印迹和隐形对照印迹为平行排列的“ Il ”直线式印迹，或“十十”字型排列印迹，或“丁丁”字型排列印迹，或“丄I”字型排列印迹，或“トト”字型排列印迹，或N ”字型排列印迹。所述保护层为吸附纤维层、磷光抗体纤维层及吸水材料层上覆盖的保护膜；在吸附纤维层与磷光抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该样品标记线偏向吸附纤维层ー侧O. 3-0. 7cm。所述磷光二氧化硅纳米颗粒采用以下方法制备 按O. 75-1. 5 2 3的体积比量取浓氨水、こ醇、水，置于反应器中混合，搅拌均匀，得到反应液A ;将正硅酸四こ酷、こ醇按1-2. 5 22的体积比混合，搅拌均匀得到溶液B ;将溶液B迅速加入到反应液A中，室温反应2h ；6500rpm离心5min,得沉淀；将沉淀用こ醇超声波洗涤，80°C烘干，于400-800°C下煅烧2-4h，即得到磷光二氧化硅纳米颗粒。所述免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤 (1)西马特罗单克隆抗体或多克隆抗体的制备； (2)磷光抗体纤维层的制备包括磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化、西马特罗抗体的标记和纤维层的制备； (3)吸附纤维层的制备吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜制成； (4)纤维素膜层的制备纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜，用点样仪在纤维素膜上不同位置分别喷点检测印迹和对照印迹，烘干后备用；(5)试纸条的组装将吸附纤维层、磷光抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从右至左依次贴在带有粘合剂的支撑层上，依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。所述磷光抗体纤维层制备的具体方法如下 (O磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化将Ig磷光二氧化硅纳米颗粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;将回流液冷却后6500rpm离心5-10min，得到的沉淀用无水こ醇洗涤，再将沉淀分散在无水こ醇中； (2)西马特罗抗体的标记将西马特罗抗体置于2-8°C、浓度O.025-0. 05 mol/L、pH9. 5的CBS缓冲液中透析8_12h ;将氨基化的磷光二氧化硅纳米颗粒10000-13000rpm离心4_8min,用所述CBS缓冲液洗漆,然后与透析的西马特罗抗体混合均匀，于2-8°C反应，过夜，得到磷光二氧化硅的抗体复合物；向抗体复合物中按I :50-120的体积比加入O. 5mol/L的氰基硼氢化钠溶液，混匀，2-8°C反应8_12h ;用质量浓度2% 的BSA溶液封闭过夜，10000-13000rpm离心4-8min，得沉淀；将沉淀用O. 5mL、浓度O. 01-0. 02mol/L、pH7. 8的Tris-HCL缓冲液洗涤后，4°C保存； (3)磷光抗体纤维层的制备将制备的磷光二氧化硅抗体复合物用含有2%酪蛋白的Tris缓本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种磷光二氧化硅纳米颗粒标记的检测西马特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、磷光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其特征在于：在纤维素膜层上设有用偶联西马特罗的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述磷光抗体纤维层采用吸附磷光抗体的玻璃纤维棉制成，磷光抗体采用磷光二氧化硅纳米颗粒标记的西马特罗抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：职爱民，张改平，胡骁飞，赵东，宋春美，杨继飞，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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