本发明专利技术公开了一种酪氯酸蛋白激酶受体EphA2优势表位复合物、其制备方法以及在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用，该复合物由摩尔比为1∶1∶1的EphA258-66表位融合肽、EphA2550-558表位融合肽和EphA2253-261表位融合肽与LIGHT基因重组真核表达载体组成；EphA258-66/550-558/253-261表位融合肽分别由EphA258-66/550-558/253-261表位与穿膜序列HIV-Tat49-57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列AAY组成；三种EphA2优势表位联合，能够有效弥补单一表位免疫效果的不足；三种表位融合肽可在穿膜序列的导向作用下进入胞浆，并在内质网滞留信号序列的作用下靶向内质网，高效进入MHC-I类抗原递呈途径；而LIGHT基因重组真核表达载体可在体内表达LIGHT蛋白，发挥分子佐剂作用，促进表位特异性T细胞的免疫应答。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种抗原表位复合物，特别涉及一种酪氯酸蛋白激酶受体EphA2的优势表位复合物，还涉及该优势表位复合物的制备方法和应用。
技术介绍
恶性肿瘤的治疗已取得很多进展，但微小残留病灶仍难以被现行的放疗、化疗、手术等方案彻底清除。应用肿瘤免疫治疗激发机体免疫监视系统，消灭残存肿瘤细胞，有可能彻底治愈肿瘤。因此，肿瘤疫苗的开发成为现今研究热点之一。针对肿瘤抗原在机体内免疫原性下降，造成特异性细胞免疫激活不足、外周免疫耐受的状况，肿瘤疫苗设计的总体思路是应用各种技术增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力，改善免疫微环境，引发有力的特异性抗肿瘤细胞免疫，从而阻止肿瘤进展，并最终消除肿瘤。CD8+T细胞是机体免疫系统的主要组成部分，在针对病毒、细菌和真菌等病原性微生物以及恶性肿瘤等的免疫监视、免疫防御以及免疫治疗过程中发挥关键性作用。细胞毒性T细胞(CTL)是通过其T细胞受体(TCR)特异识别抗原递呈细胞(APC)表面的MHC-I类分子-抗原肽复合物而得以活化，并最终杀死靶细胞。与MHC-I类分子结合的抗原肽(长 8^10个氨基酸)被定义为CTL表位。大多数MHC-I类分子仅结合内源性抗原肽，外源性抗原肽绝大多数是被APC内吞后进入MHC-II类抗原递呈途径以激活辅助性T细胞(Th细胞)， 仅有少数外源性抗原肽可被MHC-I类分子递呈，即交叉递呈。因此，如何将外源性抗原肽有效地投入MHC-I类抗原提呈途径是激发特异性CTL应答的关键。生促红素月干细胞(erythropoietin producing hepatocellular, Eph)是受体酷氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)超家族中的一个亚族，EphA2是Eph受体酪氨酸激酶之一，在人类上皮来源的多种组织或细胞中广泛表达，对调节细胞生长、迁移及血管形成有潜在的作用。近年来研究发现，EphA2在许多肿瘤组织中呈过度表达，尤其在高侵袭性的肿瘤细胞中表达更高，包括结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等，可能是恶性肿瘤治疗的一个新靶点。HIV-I的反式激活蛋白Tat能主动穿过细胞膜进入细胞内部，与Tat共价结合的异源蛋白也可被其转移到细胞内，而细胞的正常结构和功能不受影响。研究发现，由Tat第 49-57 位氨基酸残基组成的序列(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg, RKKRRQRRR)即可完全行使蛋白转导的功能，这是Tat既有穿膜特性又无细胞毒性的最小片段。内质网是MHC-I类分子递呈抗原肽的最重要场所，若将外源性抗原肽靶向转运至内质网腔，有望增强外源性抗原肽被MHC-I类分子提呈的效率。赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Lys-Asp-Glu-Leu，KDEL)基序是一种经典的内质网滞留信号序列。研究发现， 位于肽羧基末端的KDEL基序能够有效促进与之偶联的外源性抗原肽进入MHC-I类抗原递呈途径，且该抗原递呈过程表现为抗原加工相关转运体/蛋白酶体非依赖。LIGHT (homologous to lymphotoxins, inducible, competes with HSV glycoprotein D for HVEM, expressed by Tlymphocyte)是一个新发现的月中瘤坏死因子 (TNF)超家族成员，为一种II型跨膜糖蛋白，多以三聚体的形式诱导表达于活化的T细胞和选择性表达于未成熟的树突状细胞(DC)上，是一个多功能多效应分子，兼具共刺激和细胞毒两方面的活性。研究发现，LIGHT在淋巴器官的发生、肿瘤免疫、自身免疫病、移植排斥反应和抗病毒免疫中均发挥重要作用。但迄今为止，尚未见由EphA2表位、穿膜序列HIV-Tat49_57、内质网滞留信号序列 KDEL和LIGHT组成的复合物的相关报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种酪氯酸蛋白激酶受体EphA2优势表位复合物，目的之二在于提供所述酪氯酸蛋白激酶受体EphA2优势表位复合物的制备方法， 目的之三在于提供所述酪氯酸蛋白激酶受体EphA2优势表位复合物在制药领域的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案1.酪氯酸蛋白激酶受体EphA2优势表位复合物，由EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽、EphA2 253-261表位融合肽与LIGHT基因重组真核表达载体组成；所述EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽和EphA2 253-261表位融合肽的摩尔比为1:1:1;所述EphA2 58-66表位融合肽由EphA2 58-66表位、穿膜序列HIV_Tat49_57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列AAY组成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，内质网滞留信号序列位于融合肽的羧基端，EphA2 58-66表位位于穿膜序列和内质网滞留信号序列之间并分别通过接头序列与穿膜序列和内质网滞留信号序列连接；所述EphA2 550-558表位融合肽由EphA2 550-558表位、穿膜序列HIV_Tat49_57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列AAY组成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，内质网滞留信号序列位于融合肽的羧基端，EphA2 550-558位于穿膜序列和内质网滞留信号序列之间并分别通过接头序列AAY与穿膜序列和内质网滞留信号序列连接；所述EphA2 253-261表位融合肽由EphA2 253-261表位、穿膜序列HIV_Tat49_57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列AAY组成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，内质网滞留信号序列位于融合肽的羧基端，EphA2 253-261表位位于穿膜序列和内质网滞留信号序列之间并分别通过接头序列与穿膜序列和内质网滞留信号序列连接。进一步，所述LIGHT基因重组真核表达载体是在真核表达载体PCI-neo中插入 LIGHT cDNA全长序列而得到。2.所述酪氯酸蛋白激酶受体EphA2优势表位复合物的制备方法，包括以下步骤在搅拌条件下，向溶解有LIGHT基因重组表达载体的磷酸盐缓冲液中滴加摩尔比为 1:1: 1的EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽和EphA2 253-261表位融合肽的混合水溶液，滴加完毕后继续搅拌30分钟，再静置30分钟，即得酪氯酸蛋白激酶受体2优势表位复合物。3.所述酪氯酸蛋白激酶受体EphA2优势表位复合物在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。进一步，所述肿瘤治疗性疫苗为肺癌治疗性疫苗。本专利技术的有益效果在于本专利技术利用分子软件在线预测了酪氯酸蛋白激酶受体EphA2的优势表位，选取得分排名前三位的优势表位EphA2 58-66、EphA2 550-558和 EphA2 253461，融合穿膜序列和内质网滞留信号序列，分别构建了三种优势表位融合肽， 再进一步联合LIGHT基因重组真核表达载体构建了 EphA2优势表位复合物。三种优势表位联合，能够有效弥补单一表位免疫效果的不足，从而能够更有效的诱发免疫应答，得到理想的免疫效果；三种优势表位融合肽可以在穿膜序列的导向作用下进入细胞内，再在内质网滞留信号序列的作用下靶向内质网，最终高效本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．酪氯酸蛋白激酶受体ＥｐｈＡ２优势表位复合物，其特征在于：由ＥｐｈＡ２ ５８－６６表位融合肽、ＥｐｈＡ２ ５５０－５５８表位融合肽、ＥｐｈＡ２ ２５３－２６１表位融合肽与ＬＩＧＨＴ基因重组真核表达载体组成；所述ＥｐｈＡ２ ５８－６６表位融合肽、ＥｐｈＡ２ ５５０－５５８表位融合肽和ＥｐｈＡ２ ２５３－２６１表位融合肽的摩尔比为１∶１∶１；所述ＥｐｈＡ２ ５８－６６表位融合肽由ＥｐｈＡ２ ５８－６６表位、穿膜序列ＨＩＶ－Ｔａｔ４９－５７、内质网滞留信号序列ＫＤＥＬ和接头序列ＡＡＹ组成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，内质网滞留信号序列位于融合肽的羧基端，ＥｐｈＡ２ ５８－６６表位位于穿膜序列和内质网滞留信号序列之间并分别通过接头序列与穿膜序列和内质网滞留信号序列连接；所述ＥｐｈＡ２ ５５０－５５８表位融合肽由ＥｐｈＡ２ ５５０－５５８表位、穿膜序列ＨＩＶ－Ｔａｔ４９－５７、内质网滞留信号序列ＫＤＥＬ和接头序列ＡＡＹ组成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，内质网滞留信号序列位于融合肽的羧基端，ＥｐｈＡ２ ５５０－５５８位于穿膜序列和内质网滞留信号序列之间并分别通过接头序列ＡＡＹ与穿膜序列和内质网滞留信号序列连接；所述ＥｐｈＡ２ ２５３－２６１表位融合肽由ＥｐｈＡ２ ２５３－２６１表位、穿膜序列ＨＩＶ－Ｔａｔ４９－５７、内质网滞留信号序列ＫＤＥＬ和接头序列ＡＡＹ组成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，内质网滞留信号序列位于融合肽的羧基端，ＥｐｈＡ２ ２５３－２６１表位位于穿膜序列和内质网滞留信号序列之间并分别通过接头序列与穿膜序列和内质网滞留信号序列连接。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏颉，王守森，郑兆聪，袁邦青，王如密，高进喜，赵琳，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区福州总医院，
类型：发明
国别省市：35
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