本发明专利技术属于生物细胞制剂的制备，特别是指一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法。包括制备自体肿瘤相关全抗原，采取和分离培养DC细胞，用自体肿瘤相关全抗原冲击DC细胞，使DC细胞成熟并制备成自体肿瘤抗原特异性DC疫苗。本发明专利技术解决了现有技术存在的所用肿瘤抗原的免疫原性不够强、抗原靶点不完全、多数肿瘤病人的肿瘤抗原不易获得等问题。本DC疫苗具有能够有效的在体外和体内诱导肿瘤抗原特异性CTL、并能高效率的对肿瘤产生特异性杀伤、临床应用的总体有效率高、无明显毒副作用等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制剂的制备，特别是指一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细 胞疫苗的制备方法。
技术介绍
肿瘤在我国多发，近年来其发生率和死亡率逐年上升，成为威胁人类健康的主要 因素之一。肿瘤是全身性疾病，在传统的手术、放疗和化疗中，手术和放疗属于局部治疗手 段，尽管能有效减低肿瘤负荷，但难以解决转移和复发问题。化疗是传统手段中唯一的全身 治疗手段，但存在有效率低(30%左右)、副反应大、耐药性、和严重的免疫抑制等缺陷，而限 制了临床应用。因而临床期待一种副反应小、有效率高、安全、可靠的全身治疗手段。肿瘤免疫学的迅速发展，为肿瘤免疫治疗提供了一种新理念、新思路。肿瘤“免疫 监视”学说的建立，为肿瘤的发生、发展提供了一种全新的解释。肿瘤病人机体免疫系统的 “免疫监视”功能降低，致使其自身免疫系统不能有效的识别和清除变异的细胞，造成肿瘤 的发生。“肿瘤微环境”学说解释了肿瘤病人自身免疫系统的无能，导致肿瘤无限制生长的 原因。如何调动机体免疫系统对肿瘤的识别和杀伤功能，达到治疗肿瘤的目的，成为近年来 人们关注的重点问题。大量的基础研究证实，在“肿瘤微环境”下，会出现外周血⑶4+⑶25+的调节性T 淋巴细胞(Treg)水平增高，白细胞介素-10 (IL-10)、肿瘤生长因子-β (TGF-β)、白细胞 介素-4 (IL-4)、白细胞介素-6 (IL-6)等免疫抑制因子水平升高，以及树突状细胞(DC)功 能降低、肿瘤细胞的表面抗原隐匿等。特别是Treg、IL-10和TGF-β等免疫抑制因素，造成 自身免疫系统功能低下而不能有效地识别和杀伤肿瘤细胞，因而造成肿瘤的“免疫逃逸”或 “免疫耐受”。DC细胞是启动免疫系统对肿瘤进行识别和杀伤的关键细胞。DC细胞被认为是唯 一的和专职的抗原提呈细胞，DC细胞能够在致炎因子的参与下，捕获肿瘤抗原，通过细胞内 的加工过程制备成抗原多肽，然后将这些抗原多肽转移到细胞表面，并同MHC分子结合而 形成MHC-抗原复合物，同时完成由非成熟DC向成熟DC的转化，获得其提供抗原和激活T 细胞的强大功能。DC疫苗是近年来发展起来的新型肿瘤疫苗，其机理主要是将携带肿瘤抗原的DC 疫苗接种病人，以诱导体内产生持久、特异性的抗肿瘤免疫应答，达到识别和清除肿瘤细胞 的目的。目前DC诱导的肿瘤免疫治疗已经作为三类医疗技术获批应用于临床。DC疫苗的制备通常包括三个步骤首先获取肿瘤抗原，再从病人外周血获取DC细 胞，然后用肿瘤抗原冲击DC使其负载肿瘤抗原，即制备成DC疫苗。DC疫苗的制备方法很多。首先抗原的选择种类很多，如肿瘤细胞性全抗原(放 射线灭活的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物等)、肿瘤细胞的亚细胞成分(凋亡小体、外排小体 exosome、自噬小体autophage等)、肿瘤特异性抗原蛋白/多肽、肿瘤相关性抗原蛋白/多肽、肿瘤细胞mRNA、杂交融合的肿瘤细胞等。DC的来源种类也很多，可从外周血的直接分 离、从骨髓造血细胞分离、从外周血单状核细胞分离、免疫磁珠法分离等。体外抗原冲击一 般采用合适的抗原剂量，加入DC细胞的培养体系中，经过M-48小时孵育，祛除游离的抗原 和细胞碎片即获得DC疫苗。但是目前DC疫苗的临床应用受到限制，一是由于所用肿瘤抗原的免疫原性不够 强，二是由于多数肿瘤病人的肿瘤抗原不易获得，三是临床疗效有限。肿瘤特异性抗原蛋白 /多肽和肿瘤相关性抗原蛋白/多肽，抗原性弱，激活免疫的靶点单一，疫苗的免疫原性差， 目前对大多数肿瘤来说，尚无法确定其有效的肿瘤特异性或相关性抗原，且受到HLA限制， 因而很难广泛应用。肿瘤细胞mRNA虽能代表肿瘤全抗原，但制备过程复杂、容易降解而造 成抗原的缺失，临床难以推广。肿瘤细胞裂解物等，含有肿瘤细胞全抗原的蛋白或多肽，抗 原性强且完整，DC细胞摄取加工后所携带的抗原靶点全面，激发机体产生的抗肿瘤免疫全 面，因而是一种很好的抗原选择，但许多病人的肿瘤细胞难以获取或细胞数量不足，是临床 亟待解决的问题。应用蜡块标本制备肿瘤全抗原，尽管扩大了自体肿瘤抗原的来源，但标本 处理的过程中难以避免大量抗原成分的丢失，使其临床应用同样受限。用以上抗原制备的 DC疫苗，经临床应用发现疗效有限。因而，临床急需一种临床获取方便、抗原靶点完整、抗原性强且稳定、并能在临床 容易操控的特定条件下，激发机体产生强大抗肿瘤免疫应答的肿瘤特异性DC疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备 方法，采用一种自体肿瘤相关全抗原，制备自体肿瘤抗原特异性DC疫苗，并能在特定条件 下激发强大的抗肿瘤免疫反应。本专利技术的整体技术构思是，包括如下工艺步骤A、制备自体肿瘤相关全抗原；B、采取和分离培养DC细胞；C、用自体肿瘤相关全抗原冲击DC细胞，使DC细胞成熟并制备成自体肿瘤抗原特异性 DC疫苗。本专利技术的具体技术解决方案和工艺路线是 所述的步骤A包括如下工艺步骤Al、采用手术切除、内镜或穿刺活检获得的新鲜肿瘤组织、胸腹水离心获得的新鲜自体 肿瘤细胞中的一种制成自体肿瘤细胞裂解物蛋白；A2、将步骤Al中的自体肿瘤细胞裂解物蛋白和同源的细胞株裂解物蛋白混合，制备成 自体肿瘤相关全抗原。步骤Al中手术切除、内镜或穿刺活检获得的新鲜肿瘤组织采用如下方法 取肿瘤周边部分组织0. 3-1. Ocm3，剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋 白定量备用。步骤Al中胸腹水离心获得的新鲜自体肿瘤细胞采用如下方法取胸、腹水1500-2000ml，在转速为1200转/分钟条件下离心5分钟，生理盐水洗涤离 心3次，300目钢网过网后获得单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用O步骤A2中和同源的细胞株抗原混合，制备成自体肿瘤相关全抗原采用如下方法 反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量，制成同源细胞株裂解物蛋白；将同源细胞株裂解物蛋白与步骤Al中制备的自体肿瘤细胞裂解物蛋白按照质量比为1:1的比 例混合，制备成自体肿瘤相关全抗原备用。步骤B中DC细胞的采取选用外周血直接采取获得、外周血单状核细胞分离获得、 通过骨髓造血细胞分离获得、通过骨髓或其他组织来源的间充质干细胞定向分化获得、或 通过HLA基因半相合或全相合同种异体外周血、单状核细胞、骨髓造血细胞、间充质干细胞 分离分化获得方法中的一种。步骤B单状核细胞采集和分离包括Bi、单状核细胞采集前，用GM-CSF 150μβ皮下注射，1次/日，行骨髓动员2_3天； Β2、用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书中“单状核细胞采集”的设定参数设 定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞140_160ml ；B3、将步骤B2中的单状核细胞分装入50ml离心管，细胞离心机1500转/分离心5分 钟，收集上层血浆移入50ml离心管，加入质量比为10%葡萄糖酸钙溶液2. 5ml吹打混勻， 56°C水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清制备成自体灭活血清，4°C冷藏备用； B4、收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含密度为1.077g/ml的密度梯度淋巴细胞分离 液15ml的50m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤： Ａ、制备自体肿瘤相关全抗原； Ｂ、采取和分离培养ＤＣ细胞； Ｃ、用自体肿瘤相关全抗原冲击ＤＣ细胞，使ＤＣ细胞成熟并制备成自体肿瘤抗原特异性ＤＣ疫苗。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡建辉，谢绍建，杰夫·梅德因，
申请(专利权)人：蔡建辉，
类型：发明
国别省市：13
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