一种培养动物细胞生产疫苗的方法技术

本发明专利技术属于疫苗制备领域，提供了一种在片状载体培养动物细胞生产疫苗的方法，其包括：通过在片状载体上培养疫苗基质细胞，以一定浓度接种病毒，在生物反应器控制条件下继续培养细胞及病毒，收获病毒液，同时反复冻融片状载体及感染细胞，将全部收液混合成病毒悬液，制成疫苗。该方法应用片状载体培养技术在生物反应器中培养动物细胞来生产疫苗，片状载体为细胞生长及病毒繁殖提供三维空间及更大的比表面积，细胞实现更高的细胞密度，生物反应器控制培养条件等参数，可为细胞生长和病毒繁殖提供最佳生产环境，极大地提高病毒滴度，疫苗产量和质量都更稳定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体涉及，更具体的说是涉及一种通过片状载体培养动物基质细胞生产疫苗的方法。
技术介绍
传统的疫苗生产技术往往是通过接种鸡胚或动物的方法来分离、制备病毒液，但该方法因个体和种属差异，许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且因个体差异大而影响结果的判定。随着细胞培养技术的发展，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的增殖创造了条件，随着细胞大规模培养技术的发展，只要有敏感的细胞，就可以进行大规模疫苗生产。目前，疫苗的生产主要是通过转瓶工艺进行，但是该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致细胞和疫苗质量不稳定，产品批次差异大； 另一方面，单个转瓶能提供的细胞吸附生长面积有限，细胞密度只能达到1 5 X IO5Cells/ ml，产能低，同时要扩大生产规模只能通过增加转瓶数量的方法，结果是车间规模、设备通入、人员等需求更大，劳动量更大。最近，开始采用生物反应器进行疫苗生产的研究，通过生物反应器控制细胞或病毒增殖的最适培养条件，且环境均一，从而提高细胞密度和病毒产量，减少批间差异；另一方面，培养过程自动化控制，生产工艺稳定，易于规模放大，降低成本，提高效率。
技术实现思路
为了克服上述现有疫苗的生产技术所存在的缺陷和不足，实现简便、高效的生产疫苗的目的，专利技术人经过研究，提供了。具体来讲，本专利技术的技术方案如下，其包括以下步骤(1)用片状载体培养动物细胞；(2)步骤(1)获得的动物细胞上接种病毒；(3)继续培养动物细胞及病毒；(4)收获病毒液，或/和反复冻融片状载体及感染细胞，然后将全部收液混合成病毒悬液，制成疫苗。研究发现，采用片状载体在生物反应器中培养易感细胞从而生产疫苗，可以获得质量稳定的疫苗。其一是因为片状载体为细胞生长及病毒繁殖提供了三维空间及更大的比表面积，细胞可以生长到更高的细胞密度；其二是采用生物反应器可以实现自动控制培养环境参数，从而使得细胞生长和病毒繁殖处于最佳的生产环境，极大地提高了病毒滴度，从而可保证疫苗产量更大和质量更稳定。上述的步骤(4)可以采用各种方法来制备疫苗。比如，病变型疫苗可以将所收获的上清病毒液冻存于_20°C中，片状载体及细胞_20°C反复冻融2 3次，然后和上清病毒3液混合制成病毒悬液，过滤，灭活，后制备疫苗；分泌型疫苗可以将所收获的上清病毒悬液-20 0C冻存，检验合格后制备疫苗。本专利技术的片状载体包括但不限于M、N、W、Z、星型、五角形、正方形、菱形等多边形状。作为优选方案，根据本专利技术所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中所述的步骤(1)用片状载体培养细胞按以下方法进行在已经过灭菌和浸泡处理后的片状载体上接种动物细胞，在培养条件温度为37°c、pH值为6. 8 7. 6及DO (溶氧)为30 60%下培养细胞，片状载体上的细胞量达到1 3 X 108cellS/g。片状载体上接种动物细胞，在生物反应器控制培养条件下，检测营养消耗，进行补液或换液处理，培养细胞达到1 3X108cellS/ g时，片状载体上的细胞形成健康、致密的单层，有利于病毒的吸附、感染并在细胞上实现增殖。过高的细胞密度容易导致营养供应不足，过低的细胞密度则无法实现片状载体培养可实现高密度的优点，生产成本会增加。灭菌采用本领域通用的技术手段即可，比如将片状载体经伽马射线MkGy辐照杀菌。浸泡处理采用本领域通用的技术手段处理即可，比如将片状载体首先用PBS缓冲液浸泡，排尽PBS后再用培养液浸泡。作为优选方案，根据本专利技术所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中所述的片状载体上接种动物细胞，其接种量为0. 5 2X 107cells/g。接种量过高或过低在本专利技术的片状载体上都不能获得好的动物细胞培养效果。作为优选方案，根据本专利技术所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中所述的步骤(2)中，按病毒感染复数MOI为0. 001-0. 2的量接种病毒。在本文中，术语“病毒感染复数MOI ”是指每一个细胞上所感染病毒的数量。MOI=有感染力的病毒量/细胞总量。作为优选方案，根据本专利技术所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中所述的步骤(3)的继续培养细胞及病毒的条件为温度为30 37°C、pH值为6. 8 7. 8,DO为30 60%,以及病毒繁殖所需要的营养条件。根据接种的病毒，按照本领域现有技术提供其繁殖所需要的营养条件即可。作为优选方案，根据本专利技术所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中所述的步骤(4)中，病毒液直接收获并于-20°C冻存；片状载体及感染细胞于-20°C下反复冻融2 3次，最终将病毒液或/和反复冻融收液混合成病毒悬液，制成疫苗。作为优选方案，根据本专利技术所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中所述的培养动物细胞采用批式、流加、灌注或半连续的培养工艺。更优选地，所述培养细胞采用灌注培养方式。细胞灌注培养是指在细胞培养过程中，往生物反应器中不断地流加新鲜培养液， 同时通过载体对细胞的吸附使得培养液不断流出，带走代谢副产物如乳酸，氨等，使其维持在低浓度水平，不会成为细胞生长的抑制因素，所以细胞可生长在良好的培养环境中，能获得很高的细胞培养密度和产物生产速率。灌注培养具有反应器体积小，回收培养液上清体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收产品至低温下保存，有利于保持产品活性等显著特点。作为优选方案，根据本专利技术所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中所述的动物细胞选自Marc-145细胞、MDCK细胞、ST细胞、BHK-21细胞或DF-I细胞等。作为优选方案，根据本专利技术所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中所述的培养动物细胞生产疫苗的方法是在生物反应器中进行的。在本专利技术中，所采用的生物反应器包括但不限于激流式生物反应器、鼓泡式生物反应器、搅拌式生物反应器，气升式生物反应器，wave生物反应器和中空纤维反应器等。生物反应器可以实现自动控制培养环境参数， 从而使得细胞生长和病毒繁殖处于最佳的生产环境，极大地提高了病毒滴度，从而可保证疫苗产量更大和质量更稳定。具体实施例方式下面结合实施例，更具体地说明本专利技术的内容。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。 培养液DMEM培养基(DMEM培养液)，GIBCO公司。实施例1 (IOL生物反应器培养Marc-145细胞制备蓝耳病疫苗) 猪繁殖和呼吸综合征病毒CH-1R株。片状载体经伽马射线MkGy辐照杀菌后，首先用PBS浸泡，接着用PBS冲洗后，再用培养液过夜浸泡，备用。生物反应器中的片状载体上接种1 X IO7个Marc-145细胞，于DO控制在30 60%， PH值维持在7. 0 7. 2，温度37°C的条件下培养生长5 7天时间，期间检测葡萄糖消化， 根据糖耗情况进行换液处理，以使糖量维持在日耗糖量为lg/L以上为准，随着细胞密度的提高，日耗糖量逐渐增加直到达到2. 5g/L以上。排出培养液，用无菌PBS清洗两次，按病毒感染复数MOI为0. 001-0. 01的量接种猪繁殖和呼吸综合征病毒。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种培养动物细胞生产疫苗的方法，其包括以下步骤：（１）用片状载体培养动物细胞；（２）步骤（１）获得的动物细胞上接种病毒；（３）继续培养动物细胞及病毒；（４）收获病毒液，或／和反复冻融片状载体及感染细胞，然后将全部收液混合成病毒悬液，制成疫苗。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：惠觅宙，李峦峰，杜春玲，宋羚羚，戚西京，
申请(专利权)人：杭州安普生物工程有限公司，杭州安瑞普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：86