诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物和方法，所述组合物包含：20-80 μM L-抗坏血酸-2-磷酸酯，2-10 ng/ml TGF β3，50-150 nM地塞米松，10-50 μg/ml维生素C，10-50 μg/ml脯氨酸， 0.5-5 μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5-10 μg/ml的氯地孕酮酯。该组合物在用作培养基的诱导剂时，能够提高分化活性和分化定向性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学工程领域，更具体地涉及间充质干细胞向软骨诱导的组合物及诱导方法。
技术介绍
间充质干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，具有很强的自我复制能力及多向分化潜能，在一定诱导条件下可定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等，近年来作为种子细胞和细胞载体被广泛应用于软骨组织工程和基因治疗。目前采用间充质干细胞分化成软骨细胞的方法一般是将间充质干细胞培养至传代的间充质干细胞后，再在含有定向诱导为软骨细胞的因子的培养基中进行诱导培养，将间充质干细胞诱导成软骨细胞。但是由于间充质干细胞的定向诱导分化受很多不同信号通路的影响，而且诱导培养间充质干细胞的细胞微环境变化对于间充质干细胞诱导分化及其分子结构有着非常重要的影响。因此。导致现有的间充质干细胞分化成软骨细胞的方法所需周期都较长，通常需要2-4周，并且诱导后II型胶原的表达效率较低。举例而言，关节软骨因损伤而导致退变，甚至发生退行性骨关节炎，随着人口的老龄化骨关节炎的发病率正在逐渐增加。由于没有神经、血管和淋巴的分布，软骨虽然有一定的自我修复能力，但是大于5mm以上的局部软骨损伤就很那进行自我修复，关节炎类软骨疾病一直不能得到很好的手术治疗。软骨组织的传统修复方法是自体组织分离的软骨细胞经体外培养，但是却面临着成熟软骨组织扩增能力有限，随着传代次数的增加，细胞逐渐老化而丧失增殖能力，难以满足r>组织构建需要和逐渐丧失其原有特性而分化成其他组织的问题。而骨髓干细胞具有自我更新和多功能分化潜能的特性，在适当培养条件下可被诱导分化成软骨细胞，通过体细胞核转移技术有可能提供无免疫原性的“通用型”种子细胞，这将为软骨疾病的治疗提供大量的健康备用组织。干细胞向软骨细胞的分化成为医学界的热点研究问题之一。CN101014699A公开了一种去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其用于使去分化而软骨特性减弱的去分化型软骨细胞向原来的软骨细胞再分化，含有胰岛素和从BMP-2及其类似物中选择的至少一种。CN101748095A公开了一种定向诱导软骨细胞的方法，具体涉及一种采用人类羊膜上皮细胞定向诱导软骨细胞的方法，其依据组织工程基因学原理，通过体外培养人羊膜上皮细胞，进行羊膜上皮细胞的原代、传代培养，观察调整羊膜上皮细胞基因型，利用细胞因子和BMP-7诱导和调控其定向诱导分化成软骨细胞，通过分子生物学方法检测诱导分化的细胞的软骨细胞特性及软骨细胞活性，明确人羊膜上皮细胞定向诱导软骨细胞的调控机制，结果表明人羊膜上皮细胞可以作为软骨细胞诱导分化的种子源。CN102399745A公开了一种软骨干细胞分离培养方法，其中所述的软骨干细胞为由软骨组织细胞筛选而来，经特定培养基培养条件维持的成纤维样细胞，具骨、软骨及脂肪分化能力，与成体细胞相比还具有良好的扩增能力，自原代收获后可传至15代以上而保持原来特性，其利用特定培养条件进行筛选，纯化出软骨干细胞，使软骨干细胞含量在95％以上，此技术将促进软骨组织性特异干细胞的收获和应用于骨、软骨组织工程。CN103146645A公开了一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，包括如下步骤：获取间充质干细胞和软骨细胞；将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养；将所述间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中，再将接种有所述间充质干细胞的所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中，并将所述软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基后进行共同培养；其中，所述软骨细胞诱导分化培养基中含有甲状旁腺激素相关蛋白1-34。WO2014/078579A1公开了一种用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的方法，其包括：a)在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基中生长至汇合；b)在第一分化细胞培养基中培养所述细胞；c)在第二分化细胞培养基中培养所述细胞；和d)确认脂肪细胞的存在。“转化生长因子β及周期性拉伸应变条件下骨髓间充质干细胞向软骨样细胞的分化”，郝耀等，中国组织工程研究，2014(28)，研究了转化生长因子β对骨髓间充质干细胞的软骨方向分化所具有显著的诱导作用，研究发现，周期性拉伸应变可以模拟软骨细胞在体内的力学环境，对细胞的增殖和分化起着重要的调节作用，转化生长因子β及周期性拉伸应变在诱导骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化过程中是否具有协同作用。CN102899287A公开了一种采用小球法诱导培养间充质干细胞的方法，该方法可以制得无支架软骨，通过定时晃动离心管使细胞球与管底分离，保证了细胞球与诱导分化培养基充分接触，细胞球中的间充质干细胞分化状态均一，脐带源间充质干细胞相对于常规的骨髓源间充质干细胞分离制备简便，来源丰富。然而，发现在该方法中，诱导的定向性仍有待提高，例如仍含义一定量的脂肪细胞、基质细胞等其它细胞。本专利技术人在该专利的基础上，对其诱导成分进行改进，使得能够更好地模拟体内多因素联合调控的作用，更加有利于促进其软骨分化，同时通过引用将该专利全文并入本文。
技术实现思路
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术人在上述现有技术的基础上，经过深入研究和大量实验，提出了如下技术方案。在本专利技术的一方面，提供了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物，该组合物包含：20-80μML-抗坏血酸-2-磷酸酯，2-10ng/mlTGFβ3，50-150nM地塞米松，10-50μg/ml维生素C，10-50μg/ml脯氨酸，0.5-5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix(即，10μg/mlInsulin,5.5μg/mltransferrin,5ng/mlselenium,5.35μg/mllinoleicacid)，0.5-10μg/ml下式(I)所示的氯地孕酮酯，所述浓度是指在培养基中的浓度：优选地，该组合物包含：50μg/mlL-抗坏血酸-2-磷酸酯，5ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml维生素C，20μg/ml脯氨酸，2.5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，1μg/ml式(I)所示的氯地孕酮酯。当然，本领域技术人员可以理解的是，所述组合物也可以是培养基与上述诱导组分的组合。本专利技术人发现，氯地孕酮酯的浓度为1μg/ml可以获得最佳的分化效果(可例如参见图1)，浓度继续增加，分化效果反而下降，这样的效果是先前所未本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物，该组合物包含：20‑80μM L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯，2‑10ng/ml TGFβ3，50‑150nM地塞米松，10‑50μg/ml维生素C，10‑50μg/ml脯氨酸，0.5‑5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5‑10μg/ml下式(I)所示的氯地孕酮酯，所述浓度是指在培养基中的浓度：

【技术特征摘要】
1.一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物，该组合物
包含：20-80μML-抗坏血酸-2-磷酸酯，2-10ng/mlTGFβ3，50-150nM
地塞米松，10-50μg/ml维生素C，10-50μg/ml脯氨酸，0.5-5μg/ml
吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5-10μg/ml下式(I)所示的氯地孕酮
酯，所述浓度是指在培养基中的浓度：
2.根据权利1所述的组合物，该组合物包含：50μg/mlL-抗坏血
酸-2-磷酸酯，5ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml维生素C，
20μg/ml脯氨酸，2.5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，1μg/ml式(I)
所示的氯地孕酮酯。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，该组合物还包含10-100
μM的β-甘油磷酸钠。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，该组合物还包含50-200
μM雪莲和/或藏红花的提取物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，该组合物用作培养
基或培养液的成软骨诱导剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，所述培养基或培养液包括
DMEM培养液、α-MEM培养液中的任一种。
7.一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，该方法包括：
在15ml尖底离心管中使用小球法诱导培养间充质干细胞，并且每隔
约24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离，使用的诱导

\t分化培养基为高糖DMEM中加入权利要求1-3所述组成和浓度的组
合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，诱导分化培养时间为14-21
天。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述间充质干细胞
为脐带源间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
10.根据权利要求7或8所述的方法，该方法包括以下步骤：
1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：安沂华，董健伸，
申请(专利权)人：安沂华，
类型：发明
国别省市：北京;11