一种促进间质细胞NGF分泌的试剂制造技术

本发明专利技术提供了一种促进间质细胞NGF分泌的试剂，该试剂由提取自猴头菌的特定成分配伍而成，其能够有效促进间质细胞NGF分泌。还公开了该试剂的制备方法，其中特定的层析纯化方法的使用使得猴头菌中结构非常接近的活性化合物能够得到有效分离。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及促进神经生长因子(NGF)分泌的试剂，特别涉及一种促进间质细胞NGF分泌的试剂，更特别涉及一种促进间质细胞NGF分泌的组合物。
技术介绍
神经生长因子(NGF)是发现最早、最典型、研究最多的一种神经营养因子，具有明显促进神经元发育生长的作用。NGF是由神经元或胶质细胞产生、分泌，主要为胶质细胞产生。神经胶质细胞是中枢神经系统重要的细胞，其数目大约是神经元的10倍。NGF在1954年被首次发现后，得到了广泛关注和研究。NGF是神经组织生长和功能维持必需的营养和生长因子。研究表明，NGF能加速受损伤的周围神经组织的修复，另外，NGF对中枢神经机能失调例如奥兹海默和帕金森病具有积极疗效。20世纪80年代之前，人们对NGF与外周神经系统的关系已展开研究。近年来，NGF与脑缺血的关系备受关注。相应地，能够促进生成NGF的化合物得到了深入研究。天然化合物也受到关注。研究发现，儿茶酚神经介质(如肾上腺素和去甲肾上原素)或儿茶酚类似物能够促进NGF生成，然而，后来的研究发现，这些化合物具有一定的副作用，特别是具有导致神经兴奋的副作用。CN104436166A公开了一种神经生长因子(NGF)在制备治疗脊髓损伤的应用，NGF在制备治疗脊髓损伤药物中的应用，药物的形式可以是粉针剂、水剂、脂质体。NGF可以抑制内质网应激，减少内质网引起的脊髓神经元凋亡，从而对脊髓损伤产生治疗作用。CN104561095A公开了一种通过同源重组技术生产转基因小鼠的方法，所述方法通过Cas-9/CRISPR基因敲入技术，将人NGF基因取代小鼠染色体上的鼠NGF基因，通过繁殖获得带有纯合人NGF基因的基因敲入小鼠，从而获得颌下腺能够分泌人NGF的子代小鼠。CN1052868A公开了由蛋白质和神经节苷脂生成的新的,稳定的,并且具有生物学活性的络合物，即由神经生长因子的β亚基(βNGF)和天然的神经节苷脂或它的半合成类似物，如羧酸酯和酰胺生成的稳定而又具有生物学活性的络合物，以及含有这种络合物的药物组合物，它的治疗用途和生产方法。WO2004/009521A1公开了含有选自大豆皂草苷类化合物、大豆皂草配基类化合物、甘草皂草苷以及它们的盐的化合物作为有效成分的、在治疗或预防中需要增强神经生长因子(NGF)的生成的疾病的治疗药或预防药、NGF生成增强剂、以及用于增强NGF的生成的食品、饮料或饲料，还涉及具有NGF生成增强的作用的新型的大豆皂草苷类化合物和大豆皂草配基类化合物。JP27060/91公开了具有NGF生成促进活性的苯衍生物，研究了取代基对NGF生成促进作用的影响。本领域需要一种能够有效促进间质细胞NGF分泌的试剂。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术人经过深入研究NGF分泌的机制和对大量化合物的繁复筛选，提供了如下技术方案。在本专利技术的一方面，提供了一种促进间质细胞NGF分泌的试剂，该试剂包含下式(I)至(V)所示的化合物：其中，以重量比计，式(I)化合物：式(II)化合物：式(III)化合物：式(IV)化合物：式(V)化合物＝(2-5)：(2-5)：(2-5)：(10-15)：(0.1-1.0)。本专利技术人经过研究发现，该试剂的成分及其含量的特定组合能够兼顾到NGF分泌促进活性和降低副作用，即，能够实现二者的良好平衡。例如，式(V)酰胺化合物的使用能够降低式(III)、(IV)化合物的神经兴奋作用。另外，在本专利技术的试剂组合物种，不包含猴头菌中一些活性作用较低的成分例如猴头菇素F和猴头菇素G。在现有技术的猴头菌提取物中，一般是针对猴头菌的保健价值例如增强免疫、延缓衰老、抗肿瘤和抗炎症等功效展开的，因而通常分离程度不够高，提取物中含有大量可抑制NGF分泌的有机酸、脂类和生物碱。在现有技术中，尚未针对猴头菌成分对NGF分泌的影响进行细致研究，因此也就没有动机对各成分进行精细分离和配伍组合。本专利技术人经过大量筛选，获得了上述试剂配方。在一个优选实施方式中，基于该试剂的总重量计，还包含10％-70％重量的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂，乙酸乙酯：乙醇(重量比)＝1:3-3:1；或者包含20-60％重量的丙二醇溶剂，特别优选使用丙二醇溶剂。当然，本领域技术人员可以意识到，本专利技术的试剂可以按单纯组合物、片剂、丸剂等形式使用。优选地，乙酸乙酯-乙醇混合溶剂的含量为30％-60％重量。优选地，以重量比计，式(I)化合物：式(II)化合物：式(III)化合物：式(IV)化合物：式(V)化合物＝3：3：3：10：0.5。式(I)～(V)化合物均可提取自猴头菌。在式(I)～(V)化合物的提取中，优选联合使用硅胶柱和大孔树脂柱进行柱层析提取。式(I)～(V)化合物的提取可优选通过包括以下步骤的方法进行：(1)将猴头菌粉碎，然后加入为其体积5-30倍的水，搅拌均匀，然后置于60-90℃的恒温水浴锅中进行浸提，浸提时间为1-5小时；(2)将浸提后的混合物进行过滤，然后将滤液在不高于80℃的温度下进行减压浓缩，获得浓缩液；(3)向该浓缩液中加入为该浓缩液体积10-30倍的乙醇，进行醇析，醇析时间为10-30小时，将醇析后的混合物进行离心分离，获得固体物；(4)将上述固体物溶解在去离子水中，用亲水性溶剂(优选水、乙醇、丙醇)做流动相，经过大孔吸附树脂进行层析纯化，采用HPLC进行洗脱组分的监测，分别获得富含式(III)化合物和式(IV)化合物的洗脱液，将所述洗脱液在-0.06～-0.1MPa的真空度、60～80℃的条件下浓缩，分别得到式(III)和(IV)的化合物；(5)用乙酸乙酯溶剂对所述大孔树脂进行充分洗脱，将洗脱液在-0.06～-0.1MPa的真空度、30～50℃的条件下浓缩，获得乙酸乙酯浓缩液；(6)将该乙酸乙酯浓缩液用硅胶柱进行层析纯化，洗脱溶剂为乙酸乙酯-石油醚混合溶剂，二者的体积比为1:5-5:1，采用HPLC进行洗脱组分的监测，分别获得富含式(I)化合物、式(II)化合物和式(V)化合物的洗脱液；将所述洗脱液在-0.06～-0.1MPa的真空度、60～80℃的条件下浓缩，分别得到式(I)、(II)和(V)的化合物。优选地，采用纳滤或反渗透膜将式(V)化合物再次进行分离，温度控制在10～50℃。优选地，所述大孔吸附树脂是非极性大孔吸附树脂。优选地，所述大孔吸附树脂是异氰酸三烯丙基酯交联的聚乙酸乙烯酯，该大孔树脂粒径为0.2-0.6mm，基于大孔树脂的总重量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进间质细胞NGF分泌的试剂，该试剂包含下式(I)至(V)所示的化合物：其中，以重量比计，式(I)化合物：式(II)化合物：式(III)化合物：式(IV)化合物：式(V)化合物＝(2‑5)：(2‑5)：(2‑5)：(10‑15)：(0.1‑1.0)。

【技术特征摘要】
1.一种促进间质细胞NGF分泌的试剂，该试剂包含下式(I)至(V)
所示的化合物：
其中，以重量比计，式(I)化合物：式(II)化合物：式(III)化合物：
式(IV)化合物：式(V)化合物＝(2-5)：(2-5)：(2-5)：(10-15)：(0.1-1.0)。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中基于该试剂的总重量计，还包含
10％-70％重量的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂，乙酸乙酯：乙醇(重量比)＝1:3-3:1；
或者包含20-60％重量的丙二醇溶剂。
3.根据权利要求2所述的试剂，其中乙酸乙酯-乙醇混合溶剂的含量为
30％-60％重量。
4.根据权利要求1或2所述的试剂，其中，以重量比计，式(I)化合物：
式(II)化合物：式(III)化合物：式(IV)化合物：...

【专利技术属性】
技术研发人员：安沂华，董健伸，
申请(专利权)人：安沂华，
类型：发明
国别省市：北京;11