将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法技术

公开了将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法。该方法采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，其中通过加入皂苷类化合物作为诱导物，成功诱导脐带间充质干细胞分化成少突胶质细胞，并且分化比例较高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及神经生物学领域，特别设及一种将厮带间充质干细胞诱导分化成少突 胶质细胞的方法，本专利技术还设及培养得到的少突胶质细胞。
技术介绍
自2000年化ices等报道厮带血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞W来， 因厮带血间充质干细胞的多向分化潜能，免疫调节作用和无伦理问题等优点，备受研究者 的关注。随后，有学者分别报道了厮带血间充质干细胞在体外可诱导表达神经元标志物、神 经胶质细胞标志物、W及少突胶质细胞。目前人们已经可W成功地体外分离培养厮带血间 充质干细胞，并且对其生物学特性、表面标志和免疫原性有了进一步的了解。近年来成功地 诱导厮带血间充质干细胞分化为骨、脂肪、软骨、肝脏及神经等成体细胞，展示了厮带血间 充质干细胞的无限分化潜能和广阔的应用前景，从而为体外诱导厮带血间充质干细胞分化 各种成体细胞和各种疾病的治疗提供了新的思路。 厮带间充质干细胞（MSC)是中胚层起源的，能够进行自我更新，并具备向成骨、软 骨和脂肪=种中胚层系细胞分化潜能的一种成体干细胞。近年来研究发现MSC在中胚层之 夕F，还可W跨胚层进行转分化，如分化成外胚层系的神经细胞和上皮细胞W及内胚层系的 肝细胞和膜腺细胞。因为MSC来源广泛，易于分离培养，免疫原性较低，且不存在胚胎干细 胞所面临的伦理学问题，该使其在再生医学方面的应用具备了其他干细胞所没有的优势。 中枢神经系统的神经退行性疾病如帕金森氏综合征W及外部创伤造成的神经损伤等长期 困扰人类的问题也因此将有更为现实可行的解决之道。CN104004713A公开了一种将厮带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，采用 预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，通过该诱导方式， 诱导周期短、细胞分化均一度高，而且电生理检测发现该神经细胞具有诱导放电功能，成功 得到诱导的神经细胞。CN101451123A公开了 一种诱导人骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的方 法。本专利技术的目的是提供一种获得大量少突胶质细胞W用于治疗髓銷损伤或脱髓銷等疾 病。本专利技术通过简易的平板黏附法获取大量的自体人骨髓间充质干细胞，用黏附分子F3/ Contactin诱导人骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。CN101831401A公开了一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在添 加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF8、S皿和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系 中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和甜H的无血清neurobasalmedium培养体 系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。CN102337246A公开了一种刺五加巧处理人间充质干细胞得到少突胶质前体细胞 及其增殖的分化培养基，所述分化培养基包括液体基础培养基，其中，W所述液体基础培养 基的体积为基准，所述分化培养基还含有l-500ug/mL的刺五加巧、1-20体积％的胎牛血 清、5-300ng/mL人表皮生长因子巧G巧和5-30化g/mL碱性成纤维细胞生长因子化FGF);还 提供了使用前述分化培养基的制备该刺五加巧处理试剂盒的方法；还提供了包括前述的方 法获得的少突胶质前体细胞的用于治疗神经系统疾病的药物组合物。[000引CN102716467A公开了肝细胞生长因子（服F)及含有服F的骨髓间充质干细胞 (MSC)条件培养液（MSC-CM)在制备治疗多发性硬化症（MS)的药物中的应用，研究结果显 示，在髓銷少突胶质细胞糖蛋白35-55多肤片段(M0G35-55)诱导的MS动物模型EAE中，给 予含有人MSC旁分泌物质的MSC-CM能够降低EAE功能缺陷，并在功能性细胞损伤时促进少 突胶质细胞和神经元的发育，其中发挥主要作用的是MSC释放的HGF;单独给予HGF的作用 与MSC-CM相似，同样可W刺激少突胶质细胞和神经元的发育及迁移，增强髓銷修复能力， 减少MS动物模型EAE的病变负荷，促进疾病功能恢复，且给予EAE模型短暂的HGF治疗即 能持续地引导疾病功能改善。CN103388007A公开了一种利用人源性真皮多能干细胞制备组织工程脊髓的方法， 包括如下步骤；1)分离dMSCs，传代得dMSCs原代细胞；2)将分离得到的dMSCs原代细胞移 入扩增培养基中进行扩增；3)将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含深神经营养素、 维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中，静置，梯度酒精脱水后，真空干燥；将扩增后的 dMSCs,W脑源性神经营养素腺病毒表达载体感染，将细胞接种到工程脊髓材料材料上，进 行培养。CN104046589A公开了一种细胞共培养诱导干细胞体外定向分化的方法，在培养皿 底部装一环形垫片，先将干细胞接种在环形区域内，于培养箱内培养，待细胞贴壁后再将琼 脂糖/海藻酸钢混合溶液加到该环形区域，溶液固化后，加化C12溶液巧化，再加入壳聚糖 溶液反应，在干细胞上形成一层琼脂糖/海藻酸钢/壳聚糖平板复合凝胶。CN101831401A公开了一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在添 加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF8、S皿和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系 中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和甜H的无血清neurobasal-medium培养体 系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。CN103146642A公开了一种定向诱导干细胞分化的方法，包括如下步骤：将离体的 诱导细胞接种并吸附于聚碳酸醋膜的下表面，将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸醋 膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养，促使所述间充质干细胞分 化为目标细胞；所述间充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳酸醋膜的孔径。[001引 CN102191217A公开了一种诱导厮带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法，该方 法将厮带间充质干细胞与许旺细胞用0. 4ym孔径的Transwell小室隔离共培养，所用培养 液为许旺细胞培养液；每=天全量或者半量换一次液，培养两周即可得到类神经细胞。 "IGF-1诱导厮血间充质干细胞向少突胶质样细胞分化的研究"，全国优秀硕 ±学位论文，林凌，福建医科大学，2011年，公开了体外培养获得足够数量的厮血间充 质干细胞（mesenchymAlstemcells,MSCs)并对其进行诱导分化，应用膜岛素样生长因 子-l(Insulin-l;Lkegrowthfactor-1,IGF-1)、新生大鼠少突胶质细胞/II型星形胶质祖 细胞（oligoden化oc}fte/typeIIastrocyte, 02A祖细胞，也称少突胶质祖细胞)培养上清 液共培养等方法提高诱导分化的效率，在体外培养获得更多的少突胶质细胞，为少突胶质 细胞相关疾病的研究提供实验基础。MSC定向诱导分化为少突胶质细胞的实验研究尚处于开始阶段，而且现有报道的 诱导分化方法诱导周期长，得到的少突胶质细胞分化效率低、细胞分化均一度低。在上述现 有技术中，CN104004713A公开的方法通过该诱导方式，诱导周期短、细胞分化均一度高，而 且电生理当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1) 脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干细胞单体按1‑5×105/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，在35‑38℃、体积分数为5‑10%的CO2饱和湿度培养箱内培养，每3‑8天换液传代一次，得到培养的细胞；其中所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2％B27，2‑4mM L‑谷氨酰胺，1mM硫代甘油，EGF 20‑40ng/ml，bFGF 20‑30ng/ml，80‑90U/ml青霉素，和60‑70μg/ml链霉素；以及(2) 预诱导分化：将步骤(1)得到的培养细胞按1～5×104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3‑4天时终止诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加皂苷类诱导物，并且保持培养液中所述诱导物的浓度为5‑10μg/mL； 并且，其中所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM～50nM的维生素C，10‑20U/ml人白细胞抑制因子，15‑25μg/L bFGF，15‑25μg/L EGF，1‑8mM L‑谷氨酰胺，2‑5mM硫代甘油，80‑100U/ml青霉素，80‑100μg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外任选含有0.01M磷酸盐进行缓冲。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：安沂华，董健伸，
申请(专利权)人：安沂华，
类型：发明
国别省市：北京;11