一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，通过向贴壁培养的鼠胚胎干细胞团状克隆中加入含有dorsomorphin与noggin、SB431542和CHIR99021的诱导培养基，诱导鼠胚胎干细胞细胞形成玫瑰花状神经球；随后加入含有bFGF的第二阶段诱导培养基悬浮培养形成悬浮的神经球；最后将神经球消化成单细胞，然后用第三阶段诱导培养基贴壁培养形成具有较长期的自我增殖与更新的神经上皮细胞。本发明专利技术摒弃了传统的形成EB方法，缩短了分化时间，而且分化的效率达到了95％以上。本发明专利技术可快速诱导NE细胞替代NSC细胞功能治疗中枢系统损伤，具有很高的临床应用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的组合物，尤其是利用该组合物快速直接定向的诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，以及进一步将神经上皮细胞定向诱导分化成神经元细胞或神经胶质细胞的方法。 
技术介绍
神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，存在于成体脑组织中的一种干细胞。主要分布在脑室管膜，室下区，纹状体，海马齿状回等区域,是成年神经系统中可以自我更新和分化为多种神经类细胞的一种多能细胞，其可分化为多种神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞等。神经干细胞的发现，给中枢神经系统损伤和其他大脑退行性疾病的治疗带来了希望。NSCs作为一种全新的生物学治疗方法，随着分离培养、体外扩增等技术的日臻完善，NSCs在中枢神经损伤修复中具有潜在的应用价值，其应用主要集中以下几方面：一是直接细胞移植进行替代治疗，神经干细胞作为细胞移植的来源，可以通过神经干细胞的体外移植或体内神经干细胞的激活，分化为神经元和胶质细胞，与已经存在的细胞结构整合到一起；二是以NSCs作为基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)第一阶段：向贴壁培养的鼠胚胎干细胞团状克隆中加入含有dorsomorphin与noggin、SB431542和CHIR99021的诱导培养基，连续培养若干天，细胞每天换液,诱导鼠胚胎干细胞形成玫瑰花状神经球；(2)第二阶段：消化并挑出第一阶段的神经球，加入含有bFGF的第二阶段诱导培养基悬浮培养形成悬浮的神经球；(3)第三阶段：将神经球消化成单细胞，然后用第三阶段诱导培养基贴壁培养形成具有较长期的自我增殖与更新的神经上皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，其特征在于包括如下
步骤：
(1)第一阶段：向贴壁培养的鼠胚胎干细胞团状克隆中加入含有dorsomorphin与noggin、
SB431542和CHIR99021的诱导培养基，连续培养若干天，细胞每天换液,诱导鼠胚胎干细胞
形成玫瑰花状神经球；
(2)第二阶段：消化并挑出第一阶段的神经球，加入含有bFGF的第二阶段诱导培养基悬
浮培养形成悬浮的神经球；
(3)第三阶段：将神经球消化成单细胞，然后用第三阶段诱导培养基贴壁培养形成具有较
长期的自我增殖与更新的神经上皮细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述第一阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经
基础培养基、N2培养基、B27培养基、NEAA和β-Mercaptoethanol；第二阶段诱导培养基
包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、bFGF和葡萄糖；第三阶段诱导培养基包
含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、B27培养基、胰岛素、葡萄糖、bFGF和
EGF。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于第一阶段向鼠胚胎干细胞团状克隆中加入0.1～5
μM的dorsomorphin、100ng/ml～500ng/ml(4.35～21.75nM)的noggin、5～30μM的
SB431542和1～5μM的CHIR99021。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于第一阶段向鼠胚胎干细胞团状克隆中加入2μM
的dorsomorphin、100ng/ml(4.35nM)的noggin、20μM的SB431542和3μM的
CHIR99021。
5.一种快速直接定向诱导鼠胚胎干...

【专利技术属性】
技术研发人员：卞菁，郑娇，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32