本发明专利技术属于细胞生物学领域，涉及一种神经元分离和培养方法及试剂。本发明专利技术的目的在于针对现有技术存在的问题，改进当前海马神经元体外分离和培养的方法，解决了海马神经元原代培养的增殖性和活性无法保持的问题。本发明专利技术建立了一套比较成熟的体外培养海马神经元的方法，本发明专利技术得到的神经细胞数量充足，生长状态较好，能够从哺乳动物的海马组织中分离出高活性、高数量的海马神经细胞，符合原代海马细胞培养的要求，可满足神经科学研究中细胞生物学实验的需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，涉及一种海马神经细胞分离与原代培养方法及试剂。
技术介绍
海马(hippocampal)是中枢神经系统的重要组成部分，作为神经元高度集中的区域，具有中枢神经系统的典型特性，在学习、记忆、情绪反应及自主神经功能等方面发挥重要作用。神经元细胞培养模型是研究神经元发育分化、神经再生、神经疾病的发生机制等重要的实验模型，体外培养海马神经元已成为研究阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的重要技术手段。原代培养(primary culture)是指从活体细胞获得细胞、组织或器官，在体外条件下进行的第一次培养。神经元原代培养是将胚胎哺乳动物中枢神经系统的部分组织，如海马组织、大脑皮层、小脑、下丘脑、海马、脊髓和神经丛从机体直接取出，再接种培养的方法。目前国内、外有关神经元培养的方法较多，但在原代培养中神经元的纯度和产量方面还存在一些急待解决的问题。由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长。因此，体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。目前，导致难以获得足够数量和活力的原代海马神经元的因素有以下几方面：(1)海马神经组织分离过程中，多数人用D-hank′s或hank′s作为漂洗液，离体哺乳动物海马组织中去除红细胞、被膜及结缔组织等杂质，分离过程时间较长，有时候需要2小时以上，在漂洗液中时间会更长，海马神经元即已部分死亡，从而出现假阴性的培养结果。实验上无法开展海马神经元的常规培养，主要可能是因为没有合适的用于海马组织标本的神经元培养用漂洗液/解剖液之故。在组织分离过程中，即使冰浴，神经元依然进行着很大程度代谢，hank′s液的无糖环境对神经元分离很不利，在hank′s液中添加DMEM或者高糖来供给大脑的代谢，但葡萄糖浓度太高，易增加细菌污染的机会；添加DMEM培养液会碱性化，不利于神经元细胞存活。中国专利CN102978162A“一种神经元分离和培养方法及试剂”、中国专利CN102994452A“一种高效分离和培养神经元的方法”和中国专利CN102994451A“一种神经元分离和培养的改进型方法”，取脑组织放入盛有1×PBS的培养皿中，所采用清洗液均为PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12与马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，考虑到了神经元能量代谢需要，但未添加任何抗菌物质，葡萄糖浓度太高，就容易增加细胞污染的机会。(2)采用大剂量胰蛋白酶消化后，海马神经细胞势必受到相当程度的生比和机械损害；细胞表面的粘附分子或膜蛋白极易受到破坏，对于这类具有立体结构用以维持细胞增殖及自我更新的细胞来说，很难迅速恢复细胞状态，往往伴随着大范围的细胞死亡/凋亡，细胞“老化”严重，细胞活力将明显减弱，组织中不能获得大量活细胞；(3)细胞种植液对原代培养海马神经元至关重要，细胞种植液不同于接下来的细胞维持液，需要给予神经细胞特殊的生长因子，这样才能保证获得足够数量和活力的海马神经元。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷和不足，本专利技术提供了一种哺乳动物的海马神经元体外原代培养的方法，目的是建立一种简单易行、高纯度的海马神经元体外原代培养的方法及试剂，满足神经科学研究的需求。本专利技术提供的技术方案之一为：本专利技术的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)LJM-001，已于2010年08月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，保藏编号为CGMCC No.4090。本专利技术的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)LJM-001分离于一名浙江省健康青年人粪便中。本专利技术的青春双歧杆菌LJM-001菌株具有下述微生物学特征：(1)菌落形态：青春双歧杆菌LJM-001菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1～1.5mm。(2)个体形态：G+无芽孢杆菌，杆状。(3)生理生化特征：D-核糖(+)；L-阿拉伯糖(+)；乳糖(+)；纤维二糖(-)；松三糖(+)；棉籽糖(+)；山梨醇(-)；淀粉(-)；葡萄糖酸钠(-)；木糖(+)；甘露糖(-)；果糖(+)；半乳糖(+)；蔗糖(+)；麦芽糖(+)；海藻糖(-)；密二糖(+)；甘露醇(+)；菊糖(-)；水杨素(-)；F6PPK酶(+)；对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)；硝酸盐还原(-)；触酶(-)；靛基质反应(-)。厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度37～41℃；最低生长温度25～28℃；最高43～45℃；生长最适pH6.5～7.0；在pH4.5～5.0或8.0～8.5不生长。所述青春双歧杆菌LJM-001，CGMCC No.4090应用于海马神经元的细胞种植液中。我们实验过程中意外发现：青春双歧杆菌LJM-001菌株的活性发酵滤液既能提供营养成分，又可促进神经元生长，获取神经元的数量可以满足实验的需要。本专利技术提供的技术方案之二为：海马神经元的分离、原代培养方法，包括以下步骤：1.漂洗：取离体哺乳动物的海马组织，置冰浴的漂洗液中，去除红细胞、被膜及结缔组织，用漂洗液冲洗2～5次；2.消化：将步骤1漂洗后的海马组织剪成直径1mm3小块，用5倍组织体积的消化液37℃作用5～10分钟，组织成粥糜状，用细胞种植液终止消化，轻轻吹打至组织块10次以分散细胞。3.制备细胞悬液：收集步骤2消化后初次细胞悬液，经200目细胞筛过滤后，800～1000rpm4℃离心5～10分钟，弃去上清液，加入细胞种植液，重悬细胞，制成5×105～10×105个/mL的单细胞悬液；4.接种、培养：将步骤3细胞悬液种植于预先铺好多聚赖氨酸的培养皿及培养瓶中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中，种植后24～72小时换成细胞维持液，之后每隔两天用细胞维持液换液，每次更换的量为原体积的1/2。试剂购买：DMEM/F12神经基础培养基、Neurobasal培养基和B27购于Gibco公司；多聚赖氨酸、胎牛血清(FBS)、海藻糖和L-谷氨酰胺购于美国Sigma公司；青链霉素混合液(双抗)，购于美国HyClone公司。试剂的配置：(1)所述的D-Hank′s液，经过如下步骤得到：NaCl8.0本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种海马神经元的分离和原代培养方法包括以下步骤：
(1)漂洗：取离体哺乳动物的海马组织，置冰浴的漂洗液中，去除红细胞、被膜及结缔组织，用漂洗液冲洗2～5次；
(2)消化：将步骤1漂洗后的海马组织剪成直径1mm3小块，用5倍组织体积的消化液37℃作用5～10分钟，组织成粥糜状，用细胞种植液终止消化，轻轻吹打至组织块10次以分散细胞。
(3)制备细胞悬液：收集步骤2消化后初次细胞悬液，经200目细胞筛过滤后，800～1000rpm4℃离心5～10分钟，弃去上清液，加入细胞种植液，重悬细胞，制成5×105～10×105个/mL的单细胞悬液；
(4)接种、培养：将步骤3细胞悬液种植于预先铺好多聚赖氨酸的培养皿及培养瓶中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中，种植后24～72小时换成细胞维持液，之后每隔两天用细胞维持液换液，每次更换的量为原体积的1/2。
2.根据权利要求1所述的一种海马神经元的分离和原代培养方法，其特征在于所述漂洗液，经过如下步骤得到：2g海藻糖、3g葡萄糖和10mL双抗溶于100mL D-Hank′s液中，混匀，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol/L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种海马神经元的分离和原代培养方法，其特征在于所述消化液，经过如下步骤得：1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于100mL D-Hank′s液中，混匀，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol/L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种海马神经元的分离和原代培养方法，其特征在于所述细胞种植液，经过如下步骤得到：DMEM/F12培养基加入胎牛血清、活性发酵滤液和双抗，使胎牛血清终浓度为10％、活性发酵滤液终浓度为0.2％，双抗终浓度为1％，用0.22μm滤膜过滤除菌，分...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘洛贤，
申请(专利权)人：刘洛贤，
类型：发明
国别省市：
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