【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及一种诱导滤泡辅助性t细胞(follicularhelper t cell,tfh)，具有抗原特异性以及对日本血吸虫感染的早期诊断潜能的血吸虫来源多肽及应用。
技术介绍
1、日本血吸虫病的发病机制尚不清楚，目前研究认为可能是一种免疫复合物病或血清病，tfh细胞参与诱导肝脏免疫病理形成过程。日本血吸虫感染可以引起肝脾以及神经系统的疾病，严重时可危及生命。然而，高敏感性和特异性的诊断抗原的缺乏已经成为阻碍消灭日本血吸虫病目标的显著原因之一。
2、肽作为免疫原性抗原表位，在驱动适应性免疫应答中起着重要作用，已被用于多种控制寄生虫感染的试验，如sjsap4衍生肽、gp63衍生肽和hla衍生肽被鉴定用于血吸虫病血清学诊断或用于疟疾预防疫苗配方。然而，关于血吸虫来源多肽潜在免疫作用的研究尚未见报道。
3、众所周知，t淋巴细胞，尤其是滤泡辅助性t细胞在对抗血吸虫的免疫反应中至关重要，它主要位于b细胞滤泡的外围，通过表面受体cxcr5和pd-1等多种分子的表达识别，对b细胞的激活、抗体的产生和生发中心的形成起着关键作用。
4、截至目前为止，没有任何关于日本血吸虫来源多肽诱导tfh细胞产生的报道，以及其在血吸虫病诊断中潜能的报道。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的是针对以上存在的问题，提供一种能诱导滤泡辅助性t细胞(follicular helper t cell,tfh)，具有抗原特异性的多肽。
2、本专利技术的
3、进一步的，所述多肽sjp90α-1来源于日本血吸虫。
4、进一步的，所述多肽sjp90α-1刺激的树突状细胞诱导cd4+t细胞分化为tfh细胞(滤泡辅助t细胞(follicular helper t cell,tfh))，进而促进b细胞产生sjp90α-1肽抗体。
5、本专利技术的第二个目的是提供sjp90α-1肽抗体，所述sjp90α-1抗体由多肽sjp90α-1诱导产生。
6、本专利技术的第三个目的是提供前述的多肽sjp90α-1作为检测标志物在制备日本血吸虫感染和/或日本血吸虫感染引起的疾病的早期诊断试剂中的应用。
7、进一步的，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
8、进一步的，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
9、本专利技术的第四个目的是提供前述的sjp90α-1肽抗体作为检测靶点在制备日本血吸虫感染和/或日本血吸虫感染引起的疾病的早期诊断试剂中的应用。
10、进一步的，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
11、进一步的，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
12、本专利技术的第五个目的是提供检测前述的sjp90α-1肽的试剂或检测前述的sjp90α-1肽抗体的试剂在制备诊断早期日本血吸虫感染和/或早期日本血吸虫感染引起的疾病的试剂中的应用。
13、进一步的，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
14、进一步的，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
15、本专利技术的第六个目的是提供一种早期日本血吸虫感染和/或早期日本血吸虫感染引起的疾病的诊断试剂，包含检测前述的多肽sjp90α-1和/或检测前述的sjp90α-1肽抗体的试剂。
16、进一步的，所述的检测血吸虫来源多肽sjp90α-1或sjp90α-1肽抗体的试剂还包括：封闭液，酶标二抗溶液，tmb-h2o2-磷酸盐缓冲液，终止液(2mol/l h2so4)。
17、进一步的，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
18、进一步的，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
19、在某个特殊的实施例中，本专利技术所述筛选优势肽段并检测其抗原特异性免疫反应方法如下：
20、利用生物学软件分析进行抗原表位预测并选择最优多肽序列送至公司合成，然后用流式细胞术检测多肽的免疫原性，包括以下步骤：
21、(1)多肽抗原表位筛选并合成：在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库比对日本血吸虫蛋白同源性，并设计多肽。综合考虑序列长度、亲水性/疏水性、序列特异性和抗原表位性质等因素，选择最优多肽序列kgksvaadngptvapc合成，命名为sjp90α-1。
22、(2)用sjp90α-1体外刺激小鼠脾脏淋巴细胞。流式分析显示，sjp90α-1肽能够显著诱导巨噬细胞(f4/80+cd11b+mhc-ii+)，树突状细胞(mhc-ii+cd11c+)和滤泡辅助性t细胞(cd3+cd4+cxcr5+；cd3+cd4+pd1+)增加。
23、(3)将纯化的小鼠cd4+t细与sjp90α-1刺激的小鼠骨髓来源的树突状细胞(bmdcs)共培养24小时。流式结果表明sjp90α-1激活的bmdcs对诱导cd4+t细胞向tfh细胞分化至关重要。
24、(4)mbs法偶联klh载体蛋白制备抗原：多肽kgksvaadngptvap-c，溶解于pbs缓冲溶液中，巯基偶联到钥孔血蓝蛋白klh上。
25、(5)免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体：将偶联klh的sjp90α-1多肽混合物与弗氏完全佐剂等体积混合，分别皮下注射免疫2只日本大耳白兔，在一免后每个节点12、26、40、54d，将制备好的抗原与弗氏不完全佐剂混合进行2次加强免疫，每次免疫剂量为0.35mg/只；免疫67d后心脏采血，分离血清获取多克隆抗体。
26、(6)抗血清纯化：抗血清用kgksvaadngptvapc作抗原亲和纯化后，得到浓缩后的肽抗体。后续效价和特异性检测为验证步骤。
27、(7)抗血清db(斑点印迹杂交法)测定多克隆抗体效价：将抗原多肽用pbs稀释成50ng/μl，用2.5μl移液器利用反向吸液的方式每小方格取50ng/μl相应多肽稀释液2μl，点在膜(白色)上1cm×1cm正方形小格中心，即多肽包被量为100ng。点样完成后，将nc膜放入37℃烘箱中30min。然后封闭1h，将上述制备的多克隆抗体用封闭液进行倍比稀释，分别为肽抗体稀释比例为1:1000，1:5000，1:10000，1:50000，1:100000，1:200000。洗掉封闭液，并在每孔中加入相应的一抗稀释液1ml，室温孵育2h。tbst洗涤5次，5min/次；向每孔中加入1ml经1:8000稀释的酶标二抗(山羊抗兔-hrp)，孵育1h，tbst洗板5次；ecl显色液曝光。
28、(8)蛋白免疫印迹法(western blot)检测多肽特异性和交叉反应性：将实验室保存的sjp90α原核表达蛋白进行sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多肽Sjp90α-1，其特征在于，所述多肽Sjp90α-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：KGKSVAADNGPTVAPC。
2.根据权利要求1所述的多肽Sjp90α-1，其特征在于，所述多肽Sjp90α-1来源于日本血吸虫。
3.根据权利要求1所述的多肽Sjp90α-1，其特征在于，所述多肽Sjp90α-1刺激的树突状细胞诱导CD4+T细胞分化为Tfh细胞，进而促进B细胞产生Sjp90α-1肽抗体。
4.Sjp90α-1肽抗体，其特征在于，所述Sjp90α-1抗体由多肽Sjp90α-1诱导产生。
5.权利要求1所述的多肽Sjp90α-1作为检测标志物在制备日本血吸虫感染和/或日本血吸虫感染引起的疾病的早期诊断试剂中的应用。
6.权利要求4所述的Sjp90α-1肽抗体作为检测靶点在制备日本血吸虫感染和/或日本血吸虫感染引起的疾病的早期诊断试剂中的应用。
7.检测权利要求1所述的Sjp90α-1肽的试剂或检测权利要求4所述的Sjp90α-1肽抗体的试剂在制备诊断早期日本血吸虫感染和/或早期日本
8.根据权利要求5至7任意一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述早期诊断包括未有症状，或刚刚有病状初期阶段的诊断。
9.根据权利要求5至7任意一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述诊断包括病原诊断和免疫诊断两大部分。
10.一种早期日本血吸虫感染和/或早期日本血吸虫感染引起的疾病的诊断试剂，其特征在于，包含检测权利要求1所述多肽Sjp90α-1和/或检测权利要求4所述的Sjp90α-1肽抗体的试剂。
...【技术特征摘要】
1.一种多肽sjp90α-1，其特征在于，所述多肽sjp90α-1的氨基酸序列如seq id no.1所示：kgksvaadngptvapc。
2.根据权利要求1所述的多肽sjp90α-1，其特征在于，所述多肽sjp90α-1来源于日本血吸虫。
3.根据权利要求1所述的多肽sjp90α-1，其特征在于，所述多肽sjp90α-1刺激的树突状细胞诱导cd4+t细胞分化为tfh细胞，进而促进b细胞产生sjp90α-1肽抗体。
4.sjp90α-1肽抗体，其特征在于，所述sjp90α-1抗体由多肽sjp90α-1诱导产生。
5.权利要求1所述的多肽sjp90α-1作为检测标志物在制备日本血吸虫感染和/或日本血吸虫感染引起的疾病的早期诊断试剂中的应用。
6.权利要求4所述的sjp...
【专利技术属性】
技术研发人员：季旻珺，徐志鹏，沈春香，朱欣熠，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：
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