细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用技术

本发明专利技术涉及一种细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用，所述细胞培养方法包括以下步骤：在培养体系中添加改造抗体；所述改造抗体为将互补决定区以外的区域经过蛋白质改造的细胞培养用抗体，所述改造抗体与Fc受体的亲和力低于未经过蛋白质改造的细胞培养用抗体与Fc受体的亲和力。本发明专利技术的细胞培养方法和细胞培养基可用于多种细胞的体外培养，获得更高纯度、更高活力的目标细胞，所获得的细胞产品可用于临床应用研究。

【技术实现步骤摘要】
细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用
本专利技术涉及分子生物学及细胞生物学
，特别是涉及一种细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用。
技术介绍
目前，常用的细胞体外培养方法大量应用了细胞培养用抗体来结合目标细胞表面的特定受体分子，以达到激活(activating)或是抑制(blocking)信号通路的目的，促使目标细胞定向分化、持续扩增或凋亡。在小规模培养时，通常将这些抗体包被(coating)在培养皿表面，或是交联到磁珠上。在大规模培养时，为了避免冗长的难以控制的包被过程，或是为了节省高昂的磁珠成本、避免引入外源物质，或是出于其他优化工艺的目的，经常会将这些抗体直接加入培养基中。但是，这样获得的终产品普遍存在着纯度较低、活力较低的问题。目标细胞纯度低，意味着终产品中有过多的其他类型的细胞。这些非目标细胞的功能与目标细胞的不同，其成分通常难以控制，会极大增加科学试验、特别是动物和人体体内试验的复杂程度，严重影响研究的重复性。同样，在临床治疗应用上出于安全性和有效性考虑，获得尽可能高的纯度和高的活力的细胞制品也是进行细胞治疗所必需的。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种可提高细胞纯度和活力的细胞培养方法。本专利技术披露了一种细胞培养方法，包括以下步骤：在培养体系中添加改造抗体；所述改造抗体为将互补决定区以外的区域经过蛋白质改造的细胞培养用抗体，所述改造抗体与Fc受体的亲和力低于未经过蛋白质改造的细胞培养用抗体与Fc受体的亲和力。本专利技术还披露了一种改造抗体，所述改造抗体为将互补决定区以外的区域经过蛋白质改造的细胞培养用抗体，所述改造抗体与Fc受体的亲和力低于未经过蛋白质改造的细胞培养用抗体与Fc受体的亲和力。本专利技术还披露了一种细胞培养基，包含基础培养基和所述改造抗体。本专利技术还披露了一种细胞产品，所述细胞产品为根据上述细胞培养方法得到的细胞产品。本专利技术还披露了一种上述细胞产品在制备对肿瘤细胞具有杀伤作用的药物和试剂中的应用。本专利技术还披露了一种用于癌症治疗的药物，包括上述细胞产品。本专利技术还披露了一种用于异体细胞治疗的药物，包括上述细胞产品。基于上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：该专利技术适用于已建立的细胞培养工艺，对细胞培养用抗体的原有机制没有变动，对培养工艺不需要做大的改动。特别适合目前广泛使用的大规模细胞培养工艺中将细胞培养用抗体直接加入培养基的情况，操作简便。本专利技术可以提高细胞培养用抗体在细胞培养体系中的稳定性，同时也提高了抗体的利用率，通过优化培养工艺可以减少原料抗体的使用量。本专利技术避免了原代细胞培养中起始原料细胞中的免疫细胞，特别是巨噬细胞、单核细胞和NK细胞等，对目标细胞的ADCP/ADCC作用，提高了目标细胞的活率和最终产量。特别是当培养和扩增的目标细胞就是巨噬细胞、单核细胞和NK细胞等免疫细胞时，终产品中目标细胞的纯度和活力的提升更加明显。本专利技术可以提供更高纯度、更高活力的目标细胞产品，扩大了细胞产品在科学研究上的应用面，提高了细胞产品在临床应用上的安全性和有效性。附图说明图1为改造实例1中抗人CD16的鼠IgG1单克隆抗体3G8重链的改造示意图；图2为改造实例1中ProteinA柱层析的清洗和洗脱步骤的紫外吸收曲线图；图3为改造实例1中目标蛋白的还原型SDS-PAGE电泳检测图；图4为改造实例2中抗人CD52的人源化的IgG1型Campath-1H单抗重链的改造示意图；图5为改造实例2中目标蛋白的还原型SDS-PAGE电泳检测图；图6为改造实例3中抗人CD3的小鼠IgG2a单抗OKT3的改造示意图；图7为改造实例3中目标蛋白的还原型SDS-PAGE电泳检测图；图8为培养实例1中原型抗体OKT3与改造实例3制备的aCD3-SH对T细胞扩增的活力拟合曲线图；图9为培养实例2中原型抗体OKT3与改造实例3制备的aCD3-SH对NKT细胞扩增的曲线图；图10为培养实例3中采用改造抗体组扩增获得的细胞与采用原型抗体组扩增获得的细胞的流式细胞分析图；图11为应用实例1中试验组NK细胞产品和对照组NK细胞产品对Raji细胞的杀伤试验结果图；图12为应用实例1中试验组NK细胞产品和对照组NK细胞产品对BT-474细胞的杀伤试验结果图；图13为应用实例1中试验组NK细胞产品和对照组NK细胞产品对MCF7细胞的杀伤试验结果图；图14为应用实例2中两组小鼠体内的肿瘤成像信号强度图；图15为应用实例3中各组小鼠的存活曲线图；图16为应用实例3中各组小鼠的肿瘤成像图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，并给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。对本专利技术中涉及的各名词解释如下：细胞培养用抗体：泛指用于细胞培养过程中使用的抗体。原型抗体：指的是常用的市售的细胞培养用抗体，尚未经过本专利技术所涉及的改造。改造抗体：特指本专利技术中将原型抗体进行蛋白质改造后的抗体，其与Fc受体的亲和力低于原型抗体与Fc受体的亲和力。培养体系一般指的是包括培养基、生长因子、细胞培养用抗体、细胞(目标细胞和非目标细胞)、血清(有或无)、抗生素(有或无)、其他添加成分的集合，但并不限于此，根据不同的需要则培养体系的组成也不同。细胞表面的抗体受体、抗体清除和抗体依赖的杀伤某些细胞，例如淋巴细胞、DC细胞、巨噬细胞、粒细胞、血小板、肥大细胞等，其表面表达能结合不同免疫球蛋白同种型(Isotype)的Fc部分的各种受体Fc受体(FcReceptor，FcR)，包括FcαR、FcγR、FcεR等。其中，FcγR，又分为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，主要与IgG结合。FcγR与不同亚型的人和鼠IgG有着不同的亲和力。通常，对IgG1、IgG3的亲和力高于与IgG2、IgG4的。在细胞培养过程中，加入培养基中的细胞培养用抗体的浓度会不断降低。这除了与抗体会不断失活(自然降解、被细胞释放的蛋白酶降解、聚合沉淀等过程)、抗体与目标受体结合后内吞(receptor-mediatedendocytosis)等因素相关外，还与培养体系中的某些细胞表面表达的Fc受体能够结合并清除这些抗体(FcRdependentendocytosis)有直接关系。培养用的抗体通常是来本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：在培养体系中添加改造抗体；所述改造抗体为将互补决定区以外的区域经过蛋白质改造的细胞培养用抗体，所述改造抗体与Fc受体的亲和力低于未经过蛋白质改造的细胞培养用抗体与Fc受体的亲和力。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：在培养体系中添加改造抗体；所述改造抗体为将互补决定区以外的区域经过蛋白质改造的细胞培养用抗体，所述改造抗体与Fc受体的亲和力低于未经过蛋白质改造的细胞培养用抗体与Fc受体的亲和力。


2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，所述蛋白质改造的方式包括序列替换、点突变、序列插入、序列缺失、糖基化修饰和化学修饰中的一种或多种。


3.根据权利要求2所述的细胞培养方法，其特征在于，所述序列替换为将所述细胞培养用抗体的铰链区和Fc段替换为IgG2抗体或IgG4抗体的铰链区和Fc段；所述点突变为将所述细胞培养用抗体的铰链区和Fc段中的一个或多个位点的氨基酸进行突变；所述序列插入为将所述细胞培养用抗体的互补决定区插入到IgG2抗体、IgG4抗体或其他改造抗体的骨架上。


4.根据权利要求2所述的细胞培养方法，其特征在于，所述细胞培养用抗体为IgG1抗体，所述点突变为将所述细胞培养用抗体的第228位、第233位、第234位、第235位、第236位、第239位、第250位、第252位、第254位、第256位、第257位、第311位、第318位、第320位、第322位、第326位、第327位、第329位、第330位、第331位、第332位、第333位、第428位、第433位和第434位氨基酸中的一个或多个进行突变。


5.根据权利要求1～4任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，所述细胞培养用抗体为抗CD3抗体、抗CD16抗体、抗CD28抗体、抗CD52抗体或抗CD137抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：程源，
申请(专利权)人：北京时合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11