一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，采用研磨法制备细胞悬液，配合无菌巴氏吸管吹打，实现了短时间内分散斑马鱼肠道细胞，减少消化酶对细胞的损伤，提高细胞悬液中细胞浓度，以制备高质量单细胞悬液，克服了斑马鱼细胞粒径小、存活率低、难分散等分离难题；利用鱼脏器组织单核细胞分离液有效缩小了细胞分离的范围，排除了悬液中的其他细胞和死细胞；利用巨噬细胞强贴壁能力，可在4h内贴壁的特性，与其他单核细胞区分，有效对肠巨噬细胞进行纯化。与现有分离方法相比，本发明专利技术所用研磨法能够大大缩短试验时间，可在10分钟内完成细胞悬液的制备，具有更高的肠巨噬细胞的纯度，操作简单，所得细胞密度更大，减少细胞团聚。

【技术实现步骤摘要】
一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法
本专利技术属于细胞分离和培养领域，具体涉及一种分离斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法。
技术介绍
细胞培养是指在体外模拟体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，在维持主要结构和功能的前提下，使之正常生长繁殖的一种方法。动物细胞培养开始于19世纪初期，至中期规模不断扩大，至今已成为生物、医学领域中广泛采用的技术方法。该技术的出现极大地促进了对组织特异性细胞内发生的复杂生理过程的研究，从而获取完整动物模型无法得到的信息。细胞培养的对象可分为细胞系和原代细胞两大类，从机体分离后立即培养的细胞为原代细胞，细胞系则指原代细胞培养物经传代成功后所繁殖的细胞群体。细胞系的缺点在于往往与其原始组织存在不一样的遗传和表型。相比之下，原代细胞与体内原始组织在形态结构和功能活性上保持了较大的相似性，能较真实地反映体内细胞的活性与功能，是检测药物很好的实验对象。虽然原代细胞培养系统具有可直接观察细胞类型的特定过程等诸多优点，但是获得高纯度的原代细胞是十分困难的。巨噬细胞是先天免疫系统最重要的效应细胞之一，并且在适应性免疫应答的引发和激活中也起到重要作用。一种分离原代巨噬细胞的方法是直接从生物体组织中获取。Kerkhof等人1通过用含有2％淀粉的PBS悬浮液刺激小鼠腹腔，吸引巨噬细胞聚集到腹腔，从而收集腹膜渗出细胞视为巨噬细胞。Callol等人2将欧洲鳗鱼的免疫器官前肾组织置于培养基中，在100μm尼龙细胞筛网上研磨，回收细胞后进行培养。此类方法虽然简单易行，但不可避免混入其他类型细胞，导致细胞分离的精确性不足。另一种方法是将组织分散成细胞悬液，进一步筛选后获得巨噬细胞。Rogler等人3将人结肠样本用胶原酶消化分解后通过Ficoll密度梯度离心20分钟分离出单核细胞，进而与CD33孵育，特定标记后由抗CD33磁珠进行阳性分选得到巨噬细胞。此方法利用不同细胞密度的差异性，首先区分出单核细胞，缩小了分离范围，有效提高了精确度。斑马鱼是广泛用于基础和生物医学研究领域的模式脊椎动物，其肠道既是消化吸收器官，也是黏膜免疫器官，其黏膜固有层肠巨噬细胞除具有吞噬、杀伤和清除肠道病原微生物的功能外，还扮演着抗原递呈细胞的角色，发挥着启动和调节肠黏膜免疫应答的作用。目前分离人和小鼠巨噬细胞的技术较为成熟，但对于斑马鱼巨噬细胞分离技术还有很大的发展空间。并且与人和小鼠相比，可用于斑马鱼进行免疫染色的抗体的数量极少，大大缩小了分离技术的选择空间。虽然Xie等人4和Mazzolini等人5采用荧光蛋白特异性标记巨噬细胞的转基因斑马鱼系，分别使用LiberaseTL解离Tg(mpeg1.4:mCherry-F)胚胎，以及研磨(mpeg1:eGFP)斑马鱼幼鱼的大脑组织，通过流式细胞分选仪根据荧光信号分离制备原代巨噬细胞。但是有关表型特征的许多研究表明，肠道巨噬细胞与其他组织中发现的巨噬细胞或体外分化的巨噬细胞显着不同。其典型的巨噬细胞标记物表达量较低，使得基于流式细胞术的分离方法一直很困难应用于肠道巨噬细胞中。因此开发一种快速高效的分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法十分有必要。参考文献：(1)VandenKerkhof,M.；VanBockstal,L.；Gielis,J.F.；Delputte,P.；Cos,P.；Maes,L.；Caljon,G.；Hendrickx,S.Impactofprimarymousemacrophagecelltypesonleishmaniainfectionandinvitrodrugsusceptibility.ParasitologyResearch2018,117,(11),3601-3612.(2)Callol,A.；Roher,N.；Amaro,C.；MacKenzie,S.Characterizationofpamp/prrinteractionsineuropeaneel(anguillaanguilla)macrophage-likeprimarycellcultures.FishShellfishImmunol2013,35,(4),1216-23.(3)Rogler,G.；Hausmann,M.；Vogl,D.；Aschenbrenner,E.；Andus,T.；Falk,W.；Andreesen,R.；J.；Gross,V.Isolationandphenotypiccharacterizationofcolonicmacrophages.ClinExpImmunol1998,112,(2),205-215.(4)Xie,Y.；Tolmeijer,S.；Oskam,J.M.；Tonkens,T.；Meijer,A.H.；Schaaf,M.J.M.Glucocorticoidsinhibitmacrophagedifferentiationtowardsapro-inflammatoryphenotypeuponwoundingwithoutaffectingtheirmigration.DisModelMech2019,12,(5).(5)Mazzolini,J.；Chia,K.；Sieger,D.Isolationandrnaextractionofneurons,macrophagesandmicrogliafromlarvalzebrafishbrains.JVisExp2018,(134).
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，以解决目前对于斑马鱼这一物种的原代肠巨噬细胞分离和培养技术的空缺。为了解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案如下：一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，包括如下步骤：(1)取健康斑马鱼置于消毒的培养水中暂养，然后转移至含有青霉素和硫酸链霉素的消毒培养水中继续暂养12～16h；(2)处死斑马鱼后，在酒精中浸泡30s以上，转入无菌超净操作台，解剖斑马鱼，取出肠道在酒精中漂洗干净；(3)纵向划开肠道，剪碎成1mm×1mm的组织小块，在含有10vt％胎牛血清(FBS)的PBS溶液中清洗2遍以上；(4)取步骤(3)得到的组织小块在细胞筛网上进行研磨，研磨期间用含有10vt％FBS的RPMI1640培养基冲洗，收集得到细胞浓度＞108个/ml的细胞悬液；(5)取一支无菌硅化离心管，依次加入鱼脏器组织单核细胞分离液试剂盒中分离液Ⅰ和分离液Ⅱ，制成各液面分层清晰的具有梯度界面的双层分离液；(6)吸取步骤(4)得到的细胞悬液加于步骤(5)制得的双层分离液液面上，用水平离心机离心，使得离心管中的溶液分层；(7)吸取步骤(6)离心后分层溶液中环状乳白色单核细胞层到另一离心管中，加入含有10vt％胎牛血清的PBS溶液进行细胞清洗，清洗完成后，离心去除上清液；(8)取含有10vt％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，然后接种于细胞培养瓶中，在2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)取健康斑马鱼置于消毒的培养水中暂养，然后转移至含有青霉素和硫酸链霉素的消毒培养水中继续暂养12～16h；/n(2)处死斑马鱼后，在酒精中浸泡30s以上，转入无菌超净操作台，解剖斑马鱼，取出肠道在酒精中漂洗干净；/n(3)纵向划开肠道，剪碎成1mm×1mm的组织小块，在含有10vt％胎牛血清的PBS溶液中清洗2遍以上；/n(4)取步骤(3)得到的组织小块在细胞筛网上进行研磨，研磨期间用含有10vt％胎牛血清的RPMI 1640培养基冲洗，收集得到细胞浓度＞10

【技术特征摘要】
1.一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取健康斑马鱼置于消毒的培养水中暂养，然后转移至含有青霉素和硫酸链霉素的消毒培养水中继续暂养12～16h；
(2)处死斑马鱼后，在酒精中浸泡30s以上，转入无菌超净操作台，解剖斑马鱼，取出肠道在酒精中漂洗干净；
(3)纵向划开肠道，剪碎成1mm×1mm的组织小块，在含有10vt％胎牛血清的PBS溶液中清洗2遍以上；
(4)取步骤(3)得到的组织小块在细胞筛网上进行研磨，研磨期间用含有10vt％胎牛血清的RPMI1640培养基冲洗，收集得到细胞浓度＞108个/ml的细胞悬液；
(5)取一支无菌硅化离心管，依次加入鱼脏器组织单核细胞分离液试剂盒中分离液Ⅰ和分离液Ⅱ，制成各液面分层清晰的具有梯度界面的双层分离液；
(6)吸取步骤(4)得到的细胞悬液加于步骤(5)制得的双层分离液液面上，用水平离心机离心，使得离心管中的溶液分层；
(7)吸取步骤(6)离心后分层溶液中环状乳白色单核细胞层到另一离心管中，加入含有10vt％胎牛血清的PBS溶液进行细胞清洗，清洗完成后，离心去除上清液；
(8)取含有10vt％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，然后接种于25cm2细胞培养瓶中，在28℃、5％CO2培养箱中培养4h，通过差异贴壁法对肠巨噬细胞进行纯化，培养4h后弃去全部陈旧培养基，加入含有10vt％胎牛血清的新...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴兵，顾纬卿，余静，吴小梅，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32