一种重组人纤连蛋白肽制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，更具体地公开了一种重组人纤连蛋白肽。本发明专利技术公开的是密码子优化的重组人纤连蛋白肽基因，通过基因工程的方法在体外进行表达纯化。本发明专利技术提供的利用大肠杆菌作为表达宿主细胞，提供一种分子量小，且保留了纤连蛋白原本特性，可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平的重组人纤连蛋白肽。

A recombinant human fibronectin peptide

【技术实现步骤摘要】
一种重组人纤连蛋白肽
本专利技术涉及到基因工程领域，具体地说，涉及一种重组人纤连蛋白肽的制备方法。
技术介绍
纤维连接蛋白（简称纤连蛋白）又称纤维结合蛋白、粘连蛋白、纤粘蛋白，英文名fibronectin，英文缩写Fn。纤维结合蛋白主要由肝脏及血管内皮细胞生成，广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子糖蛋白，二聚体分子量约为450KD，具有多种生物活性。Fn分子在进化过程中保守性很强，各种动物体液中的Fn具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因而不同来源的Fn可以相互替代使用。纤连蛋白可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平，缩短细胞生长时间，提高杂交瘤技术中细胞融合率等。然而现有的纤连蛋白由于分子量过大加工性较差，并且大多从动物组织中提取，是一种异源蛋白，具有一定的排斥反应，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险。通过基因重组及生物工程技术直接生产出结构、特性、生物学功能与人类纤连蛋白极为相似的重组人纤连蛋白肽，不仅解决现有的纤连蛋白分子量过大，加工性较差的缺点，而且能够减少排异反应，规避感染疾病的风险，同时保留了人纤连蛋白的优良生物学性能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种分子量小，且保留了纤连蛋白原本特性，可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平的重组人纤连蛋白肽。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种重组人纤连蛋白肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在上述的重组人纤连蛋白肽中，其还包括用于蛋白纯化的His标签。编码上述重组人纤连蛋白肽的核酸，并进行大肠偏好密码子优化，优化序列有SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4；优选为SEQIDNO.2。其还包括用于蛋白纯化的His标签。一种用于表达上述重组人纤连蛋白肽的载体，为pET-28a、pET-20b或pQE-30。一种宿主细胞，其包括上述的表达载体，为M15或BL21(DE3)。一种上述重组纤连蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）在宿主细胞中表达根据权利要求3或4或5所述的核酸；（2）收集和/或纯化所述重组人纤连蛋白肽。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术截取纤连蛋白氨基酸序列第12~14区域，得到了分子量小，且保留了纤连蛋白原本特性的重组纤连蛋白，可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平。本专利技术获得的重组纤连蛋白兼具纤连蛋白的特性，能使创伤面修复再生，复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。该重组纤连蛋白具有人源化，免疫原性低，不易发生过敏反应的突出优点。同时也可以作为组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂。附图说明图1为大肠杆菌重组表达质粒pET20b-Fnp的构建图谱。图2为重组蛋白Fnp基因片段扩增。泳道1为DL2000DNAmarker；泳道2表示扩增的重组蛋白Fnp基因，约840bp；泳道3为阴性对照。图3为含重组蛋白Fnp的SDS-PAGE分析。a.M:蛋白分子量标准，泳道1、3、5分别对应未诱导的BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1、BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2、BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3表达系统；泳道2、4、6分别对应已诱导的BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1、BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2、BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3表达系统（将使用序列SEQIDNO:2的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1，使用序列SEQIDNO:3的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2，使用序列SEQIDNO:4的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3）。结果显示，BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1表达量均高于BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2和BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3的表达量。后面实验使用的序列默认为SEQIDNO:2。图4为含重组蛋白Fnp纯化后样品的SDS-PAGE与Westernblot分析。a.M:蛋白分子量标准，泳道1：Fnp纯化后样品；b：M：蛋白分子量标准，泳道1：Westernblot鉴定Fnp。结果显示，纯化后的Fnp蛋白可见少部分二聚体。图5为Fnp蛋白对HaCat细胞的促粘附作用。结果显示，市售牛纤连蛋白可提高HaCat（ATCCNo:CM-1252）细胞粘附率，本专利的Fnp在0.0781nmol/mL~1.250nmol/mL之间的粘附作用优于市售牛纤连蛋白。图6为Fnp蛋白对HaCat细胞的划痕愈合作用。结果显示给药24h后，与空白组相比，蛋白浓度为10nmol/mL的Fnp促细胞划痕愈合效果明显优于空白对照组和10nmol/mL的市售牛纤连蛋白。图7为CS-Glu/PEG-BA水凝胶中HUVEC细胞的形态和分布图。培养时间：A)6h；B)72h；C)168h；D-F为A-C对应的图像。结果显示细胞培养72h和168h后，本专利技术的Fnp（200ug/mL）促进HUVEC细胞粘附CS-Glu/PEG-BA水凝胶的效果明显优于空白对照组。具体实施方式下面结合附图对本专利技术进一步说明，但是本领域技术人员应该理解本专利技术并不限于这些具体的实施例。除非另外指明，下述实施例中所用的空质粒均为可商购获得的质粒。重组质粒采用常规分子克隆方法构建。实施例1：重组人纤连蛋白肽在大肠杆菌中表达1构建重组表达人纤连蛋白肽的表达载体：将编码重组人纤连蛋白肽的DNA片段(SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4，将使用序列SEQIDNO:2的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1，使用序列SEQIDNO:3的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2，使用序列SEQIDNO:4的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3。BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1、BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2、BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3的诱导结果如图3所示，结果显示，BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1表达量均高于BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2和BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3的表达量。后面实验使用的序列默认为SEQIDNO:2。)送到金唯智生物科技有限公司进行全基因合成，在所述Fnp核苷酸序列的5’端和3’端分别加入Nde1和Hind111(TAKARACo.Ltd)酶切位点，利用Nde1和Hind111双酶切表达载体pET20b（Tiandz，货号60908-2782）并进行回收，将回收的片段与合成产物用T4DNA连接酶连接以构建重组质粒pET-20b-Fnp。2重组人纤连蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人纤连蛋白肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组人纤连蛋白肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的重组人纤连蛋白肽，其还包括用于蛋白纯化的His标签。


3.编码根据权利要求1或2所述的重组人纤连蛋白肽的核酸，并进行大肠偏好密码子优化，优化序列有SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4。


4.根据权利要求1所述的核酸，其序列如SEQIDNO.2所示。


5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：项琪，黄亚东，程雅婷，曹苗苗，
申请(专利权)人：广州暨南大学医药生物技术研究开发中心，
类型：发明
国别省市：广东;44