本发明专利技术涉及一种长白猪RBM3基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术还提供了含有该基因的重组慢病毒载体和构建方法以及在提高猪的抗寒能力中的应用。本发明专利技术成功的构建了含RBM3基因的慢病毒载体plenti6/v5-RBM3；该载体能够使RBM3基因稳定长效表达，而且转染效率较高；通过将含有RBM3基因的重组慢病毒液注入猪体内后，可提高长白猪体内冷休克蛋白RBM3的含量，增加长白猪的抗寒能力。
Construction and application of pig RBM3 gene and its recombinant lentiviral vector
The invention relates to a pig RBM3 gene, the nucleotide sequence of SEQ? ID? NO.1 shows. The invention also provides a recombinant lentiviral vector containing the gene and a method for constructing the recombinant lentiviral vector and the application thereof. The present invention successfully constructed the lentiviral vector plenti6/v5-RBM3 containing RBM3 gene; the RBM3 gene carrier can make long-term stable expression, and high transfection efficiency; pigs injected by recombinant lentiviral solution containing RBM3 gene, can improve the content of Landrace cold shock protein RBM3, increase the cold hardiness of landrace.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学、生物医药及其基因工程
，涉及长白猪RBM3基因及其重组慢病毒载体的构建和应用，特别涉及能够提高猪的抗寒能力的长白猪RBM3基因及其重组慢病毒载体的构建和应用。
技术介绍
1936年，加拿大生理学家Hans selye提出应激这一概念。他认为家畜对干扰或者妨碍动物机体正常机能的外界或内部的各种异常刺激所产生的生理和行为上非特异性反应的过程即为应激。产生应激因素有很多中，其中以气候因素最为常见，气候因素主要包括空气中的温度、湿度、气压。由温度导致的应激，应激可以分为冷应激、热应激两种。我国北方地区春冬寒冷季节气候条件相当恶劣，气温骤降，或者遇到同时夹杂着暴风雪的天气时，因环境温度过低所导致的冷应激常常引起动物抵御自然灾害的能力减弱，例如，猪对寒冷比较敏感，尤其是新生仔猪，当环境温度过低时会严重影响猪的生殖能力和新生仔猪的存活率，从而引起其生产性能降低，表现为生长缓慢、产仔率低、发病率高及死亡率高等问题，给养猪业造成不可估量的经济损失。虽然技术人员就对抗冷刺激做出了许多防御措施，例如改善饲养管理，加强营养调控等举措，但是对于气温的骤降，饲养者并不能做出及时的防护。怎样能够降低冷刺激对猪的伤害是研究者们关注的一个重要问题，这种环境问题迫切的要求研究者们发现一种能够提前预防寒冷刺激的方法。1997年Danno等人在人类胎儿的脑组织中分离鉴定得到了这个富含甘氨酸的冷休克蛋白RBM3。RBM3是一种多功能的蛋白质，在对抗缺氧、寒冷等有害刺激时，细胞中RBM3的表达量会明显升高以达到保护细胞的作用。许多研究者就动物处于冷环境时其生理变化进行研究，并在动物体内发现了当动物处于冷刺激状态时，机体内大部分蛋白质的合成受到了抑制，但是机体内的冷休克蛋白的合成量却显著升高。 动物体内主要的冷休克蛋白有冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducibleRNA-binding protein, CIRP)和 RNA结合基序蛋白 3(RNA binding motif protein3, RBM3),近些年来越来越多的研究者们致力于冷休克蛋白的研究，但是大多数研究都是围绕CIRP开展的，关于RBM3的研究还很少,而RNA结合基序蛋白3 (RNA binding motif protein3,RBM3)又是哺乳动物体内一种重要的冷休克蛋白。这种蛋白可以提供动物机体抵抗寒冷的能力。但目前大多数学者对于RBM3蛋白的研究仅仅停留在对动物体内蛋白功能的表达，体外研究的未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供长白猪RBM3基因。本专利技术的第二个目的是提供含有上述长白猪RBM3基因的重组慢病毒载体。本专利技术的第三个目的是提供上述长白猪RBM3重组慢病毒载体的构建方法。本专利技术的第四个目的是提供上述长白猪RBM3重组慢病毒载体在提高猪的抗寒能力中的应用。本专利技术通过以下技术方案来实现:一、一种长白猪RBM3基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。二、含有上述长白猪RBM3基因的重组慢病毒载体。三、上述长白猪RBM3重组慢病毒载体的制备方法，该方法包括以下步骤:(I)提取长白仔猪脾脏组织样中总RNA，以其反转录的cDNA为模板，PCR扩增得到目的基因RBM3片段，所用引物序列为:上游引物:5，-cgggatccctgccatgtcctctgaagaag-3，(SEQID N0.2)下游引物:5，-ccgctcgagacagccatttggaaggacg-3，(SEQID N0.3)；(2)将目的基因RBM3片段连入T载体进行克隆；(3)将克隆得到的目的基因RBM3片段连入入门载体pENTR-11 ；(4)通过Gateway技术，将目的基因RBM3片段连入真核表达载体Plenti6/v5_DEST中，得到重组慢病毒载体Plenti6/v5-RBM3。四、上述的长白猪RBM3重组慢病毒载体在提高猪的抗寒能力中的应用，通过所述的重组慢病毒载体转染到293T细胞中获得含有目的基因RBM3的重组慢病毒液，该重组慢病毒液注入长白猪体内后，可提高长白猪体内冷休克蛋白RBM3的含量，增加长白猪的抗寒能力。采用上述技术方案的积极效果:本专利技术成功的构建了含长白猪RBM3基因的慢病毒载体plenti6/v5-RBM3 ;该载体能够使RBM3基因稳定长效表达，而且转染效率较高；通过将含有RBM3基因的重组慢病毒液注入猪体内后，可提高长白猪体内冷休克蛋白RBM3的含量，增加长白猪的抗寒能力。附图说明图1是长白仔猪脾脏组织中RBM3基因的RT-PCR检测结果图；M:marker, I, 2:仔猪脾脏组织；图2连接RBM3基因的T载体的PCR检测结果图；M:marker, I, 2:连接 RBM3 基因的 T 载体；图3是连接RBM3基因的T载体的双酶切检测结果图；M:marker, I, 2:连接 RBM3 基因的 T 载体；图4是重组载体pENTR-ll-RBM3的PCR检测结果图；M:marker, I, 2:重组载体 pENTR_ll_RBM3 ；图5是重组载体pENTR-ll-RBM3的双酶切检测结果图；M:marker, I, 2:重组载体 pENTR_ll_RBM3 ；图6是重组慢病毒载体plenti6/v5-RBM3的PCR检测结果图；M:marker, 1:重组慢病毒载体 plenti6/v5_RBM3 ；图7是重组慢病毒载体plenti6/v5-RBM3的双酶切检测结果图；M:marker, 1:重组慢病毒载体 ple nti6/v5_RBM3 ；图8是感染重组慢病毒的293T细胞中RBM3基因的RT-PCR检测结果图；M:marker, 1:未感染病毒的293T细胞，2，3:感染病毒的293T细胞；图9是感染重组慢病毒的ST细胞中RBM3蛋白的Western blot检测结果图；1:未感染病毒的ST细胞，2:感染含空载体慢病毒的ST细胞，3:感染含RBM3重组慢病毒的ST细胞。具体实施例方式下面结合实施例和对比例对本专利技术的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本专利技术的限制: 本专利技术中的生物材料来源:1、RBM3基因的引物为自行设计并委托上海生物技术服务有限公司合成；2、T载体、入门载体pENTR-11、慢病毒载体pLenti6-V5_DEST均为市售产品，T载体购于Promega公司；入门载体pENTR-11、慢病毒载体pLenti6_V5_DEST购于Invitrogen公司。实施例1本实施例用于说明RBM3基因的获取和鉴定:首先根据长白猪RNA结合基序蛋白3的基因序列(GenBank登录号为:NM_001243419)设计引物序列，上游引物:5，-cgggatccctgccatgtcctctgaagaag-3，(SEQID N0.2)下游引物:5，-ccgctcgagacagccatttggaaggacg-3，(SEQID N0.3)。 取2 3月龄健康的长白仔猪，取其脾脏组织于液氮中放置一天后保存于负80°C冰箱中待用。第二天提取冻存长白仔猪脾脏组织样中总的RNA，反转录合成第一条链cDNA，以此链为模板，通过上述合成的引物进行PCR反应。PCR反应体系共25.0 μ L，10XPCRBuffer (本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种长白猪RBM3基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李士泽，李俭，杨玉英，杨焕民，计红，李玉恒，孟宇，李静辉，张雪，李云龙，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：
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