甘蓝型油菜基因Bnms4制造技术

本发明专利技术公开了一种利用油菜基因

【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜基因Bnms4b在制备黄叶烟草中的应用
本专利技术属于基因工程和生物
，具体涉及一种油菜基因Bnms4b在制备黄叶烟草中的应用。
技术介绍
油菜杂种优势利用关键在于优良的授粉控制系统和双亲之间是否可以获得具有一定生产潜力的杂交种。相对于油菜细胞质雄性不育系统，隐性细胞核雄性不育系统有诸多天生的优点，主要表现为败育彻底，育性稳定，恢复源广，无不良胞质负效应，且有的核不育类型能获得全不育制种群体而具有良好的应用前景。本课题组克隆了甘蓝型油菜隐性核不育两型系7365AB系统的核不育基因Bnms4b，并将该基因及其育种应用申请了专利保护(申请号：201510067850.8)，该基因可导致多种十字花科植物产生不育表型，且不育表型具有败育彻底，无不良胞质负效应的特点，可以用于植物杂种优势利用和进行分子标记辅助育种。光合作用是地球上最大规模利用太阳能的过程，它为几乎所有的生命活动提供有机物、能量和氧气。光合作用是植物将太阳能转换为化学能，并利用它把二氧化碳和水等无机物合成有机物并释放出氧气的过程(沈允刚，2006)。光合作用效率与叶绿体的结构和功能是否完整，光合作用复合体的稳定性，叶绿素含量的高低都有着复杂的关系。叶绿素的减少或缺失将使叶片颜色变浅，叶绿素缺乏往往使植物发育迟缓、生物学产量降低、生长势减弱，甚至导致死亡，因此过去常被认为是无义突变，直到1949年，Gran-ick首次对发生失绿突变的小球藻(chorella)研究后，并用于阐明叶绿素合成的过程(雷红梅，2010)，才使人们认识到了黄叶突变体在理论研究上的重要价值。叶色黄化突变体作为一种特殊材料，对研究高等植物的叶绿体结构、叶绿素生物合成途径、光合机理、遗传控制等具有特殊价值(常青山等，2013)。叶绿素合成调控机理非常复杂，所以研究和开发影响叶绿素合成的相关基因，对提高植物的光合效率和产量至关重要。烟草的叶片，既是营养器官又是产品器官。烟草叶片的生长状况决定了烟草品质的好坏，探究烟草叶绿素的合成和降解因素，对揭示叶绿素的代谢，通过人工改造提高光能利用效率和作物产量具有重要的意义。近些年来，叶色的应用价值备受关注，叶色变异可以作为标记性状用于基因工程创建，在育种繁育方面发挥重要的作用，不但可以用于苗期剔除受外援花粉污染的种子和假杂种，还可以用于测定种子纯度(章志兴，2001；魏祥进，2013)。此外，叶色突变可以用于观赏性植物的叶色基因工程创建。植物叶色的变异，可以形成丰富的景观效果，增添不同的视觉感官，丰富城市的自然景观，体现城市的个性。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供油菜基因Bnms4b在制备黄叶烟草中的应用，所述基因如SEQIDNO.1所示，利用农杆菌侵染的方法将Bnms4b基因转化到烟草叶片中，可显著降低烟草叶片中叶绿素含量，破坏叶绿体的形态建成，使烟草叶片出现黄化表型，方法简便可行。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术方案：一种甘蓝型油菜基因Bnms4b在制备黄叶烟草中的应用，其方法是：1.载体的构建：将基因Bnms4b的全长gDNA序列(如SEQIDNO.1所示)连接到pCAMBIA2300载体中，构建农杆菌侵染载体pCAMBIA2300-Bnms4b，图1是该载体的构建示意图；2.烟草的遗传转化：通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的甘蓝型油菜基因Bnms4b导入野生型烟草中，培育筛选获得转基因烟草阳性苗(包括植物各部分组织)，所得到的转基因烟草表现出叶片黄化的表型；3.阳性苗的鉴定：提取转基因烟草幼嫩叶片的DNA，设计相应引物对Bnms4b基因进行PCR扩增检测，以确定阳性转化株，检测引物的正向序列为F：5'-AGTCCTTCCCTTTACTCAGCTC-3'，反向序列为R：5'-GATTTTATCAATGACAAAAAA-3'。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：本专利技术利用基因转化技术创建黄化烟草植株，所得的黄化烟草植株自苗期乃至整个生长过程有持续黄化的现象，且其后代的黄化表型可以稳定遗传。利用烟草的黄叶性状可通过叶色标记技术进行烟草的杂种优势育种繁种，剔除假种和检验种子纯度。同时通过研究烟草叶片的黄化机理，对揭示烟草叶绿素形成和降解，通过人工改造提高光能利用效率及抵抗生物和非生物胁迫具有重要的意义。附图说明图1为pCAMBIA2300-Bnms4b表达载体构建示意图，其中(A)图为pCAMBIA2300的空载体图谱，(B)图为构建的植物表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b的图谱。图2为转基因烟草阳性苗PCR检测，其中C为包含Bnms4b基因的阳性对照；阴性对照为WT(野生型烟草)与water(水)；M：分子量标记Maker，T1至T8为转Bnms4b基因烟草植株扩增结果。图3为Bnms4b基因转化烟草所得的转化植株与野生型烟草的黄化表型对比图。Y1为转基因烟草阳性苗，WT为野生型烟草。图4为烟草转化植株与表型相对应的叶绿素含量测定。Tob1到Tob4为转基因烟草叶片由黄到绿的梯度图，WT为野生型烟草。图5为烟草转化植株叶绿体形态的透射电镜观察。Tob1到Tob4为转基因烟草叶片由黄到绿的梯度图，WT为野生型烟草。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步定义本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。采用常规农杆菌侵染法进行烟草的遗传转化。本专利技术中转化的品种为野生型烟草，为华中农业大学实验基地常规种植(华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室叶志彪教授赠送)。本专利技术中所用的农杆菌侵染载体pCAMBIA2300-Bnms4b由本实验室的夏胜前老师赠予，图1是该载体的构建示意图。实施例1：农杆菌侵染载体pCAMBIA2300-Bnms4b的构建方法本实施例通过对Bnms4b基因的gDNA全长序列进行酶切位点分析，发现其可以不被KpnI和SalI酶切。设计扩增基因全长的引物CC2F(R)，左右引物分别加上SalI和KpnI的酶切位点，利用高保真PCR聚合酶(PhusionTMHigh-FidelityDNAPolymerse,来自NewEnglandBiolads公司)分离基因全长序列，将扩增片段(如SEQIDNO.1所示)克隆到pCAMBIA2300(华中农业大学作物遗传改良国家实验室林拥军教授赠送)载体上，测序结果表明序列完全准确，没有错配碱基存在。提取插入片段序列正确的克隆的融合质粒，并转化大肠杆菌DH5α(购自北京全式金公司)，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，酶切检测准确的克隆所包含的载体就是包含正确Bnms4b全长的融合载体pCAMBIA2300-Bnms4b(图1)。将载体质粒通过电转化的方法转导GV3101农杆菌菌株中(本实验室长期保存的菌株)，在含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL庆大霉素的固体培养基上挑取单克隆，并进行PCR检测确认阳性克隆后，将该单克隆于-80℃保存起来，用于野生型烟草的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用油菜基因Bnms4

【技术特征摘要】
1.一种利用油菜基因Bnms4b制备黄叶烟草的方法，其步骤是：A.以pCAMBIA2300载体作骨架，构建植物表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b，用所述的植物表达载体转化农杆菌；B.通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的甘蓝型油菜基因Bnms4b导入野生型烟草中，培育筛选获得转基因烟草阳性苗；C.提取转基因烟草幼嫩...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂金星，田甜甜，秦毛毛，马朝芝，沈金雄，易斌，文静，傅廷栋，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42