本发明专利技术是一种由假单胞菌产生的具有抗肿瘤活性的天然产物－ＦＲ９０１４６４的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇共包含２０个基因：５个聚酮合成酶基因，１个杂合的聚酮／非核糖体聚肽合成酶基因，１个非核糖体聚肽合成酶基因，３个独立的酰基转移酶基因，４个与聚酮骨架烷基化相关基因，４个后修饰基因，２个调控相关基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断ＦＲ９０１４６４的生物合成。本发明专利技术所提供的基因及其蛋白可用于该化合物的基因工程、蛋白表达、酶催化反应等，也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗肿瘤天然产物FR901464 的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。
技术介绍
1996 年，日本科学家从假单胞菌(Pseudomonas sp. No. 2663, FERMBP-3421) 的发酵培养液中分离得到了三种化学结构非常类似的化合物FR901463，FR901464, FR901465(图1)，这类化合物通过一种新发展的体外筛选系统-转录调控得到。它们可以 通过增强SV40启动子的转录活性，同时引起细胞周期 停留在Gl和G2，M期，降低致癌基因和肿瘤抑制子基 因的mRNA水平降低，从而有效地抑制哺乳动物和人类体外肿瘤细胞的生长，其中以化合物 FR901464的生物活性最好，半致死量(IC5tl)仅为0. 6-3. 4nM。用FR901464处理的细胞表型发生了变化，其作用效果类似于组蛋白去乙酰酶抑制剂(trichostainA) ，但是在分析分离的组蛋白乙酰化的过程 中，发现FR901464并不是组蛋白去乙酰化酶的抑制剂。FR901464这些意外的药理学特性引 起了许多化学家合生物学家的兴趣。实验证明它们可以延长腹部生长肿瘤的小鼠的生命。 用FR901464处理细胞可能破坏染色质的结构，同时产生“生物活性染色质”，这一活性物质 可以导致含有病毒启动子的转录活性，但是却抑制内源诱导基因，核仁小体DNA片段被内 源基因消化，细胞周期阻滞在检验点。很可能剪切体抑制剂会在核内斑块引起明显的形态 学变化，并在这些斑块中有部分聚RNA的积累。最近的研究证实，FR901464和它甲基化的 类似物spliceostain A均可以抑制mRNA前体的剪切，通过非共价结合U2小细胞核核糖核 酸蛋白的 SF3b 亚复合体。从物理化学的数据可以看出，FR901464及其类似物拥有独特的化学结构，共轭的 双烯及共轭的氨基羰基作为边链。最近，许多小组完成了它的全合成，及其稳定性更好的类 似物 meayamycin-缺少半缩酮基团，表明比天然 产物的活性更高。甲基化修饰FR901464-spliceostatinA，是SF3b剪切体因子的小分子抑制剂。以前的构效关系研究表明FR901464右 臂的卟啉环对于生物活性很重要，后来发现将第四位的碳乙酰化会极大的降低化合物的活 性。特别的是，在环氧的位置上引入环丙烷，FR901464的活性会完全丧失，因此，环氧才是 最重要的活性位点。环氧基团表明有高度的反应活性，在相关的物理条件下，通过β消除 可以得到两个酮烯，其中一个通过脱水可以形成呋喃。本专利技术以微生物来源的FR901464为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，采用 微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过对其生物 合成机制的研究揭示FR901464及其类似物的独特化学结构形成的酶学机理，在此基础上 运用代谢工程的原理，合理修饰FR901464的生物合成途径，探索结构稳定、活性更好、并能 通过微生物发酵大量生产的新型药物。
技术实现思路
本专利技术涉及一种具有独特聚酮结构的天然产物FR901464的生物合成基因簇的克隆、分析、功能及其应用。本专利技术中整个FR901464的生物合成基因簇共20个基因的核苷酸 序列或互补序列(序列1)，其中7个(fr9C，fr9D，fr9E，fr9F，fr9G，fr9H，fr9I)用于编码 I型聚酮合成酶(PKS)及非核糖体聚肽合成酶(NRPS)，共包含9个模块，53个功能域，负责 催化FR901464骨架部分聚酮链的生物合成；3个基因(fr9B，fr9J，fr90)编码的蛋白负责 将前体丙二酰辅酶A承载到PKS的载体蛋白结构域上；2个调控基因(fr9A和fr9Q) ；8个 基因(fr9K，fr9M, fr9N, fr9L, fr9P, fr9R, fr9T, fr9S)编码的蛋白对 FR901464 骨架进行 后修饰。本专利技术还提供了一个编码转录调控子的核苷酸序列，由序列2中的氨基酸序列组 成，命名为Fr9A，其基因的核苷酸序列位于序列1中第11932-12816碱基处。本专利技术还提供了一个编码酰基转移酶的核苷酸序列，由序列3中的氨基酸序列组 成，命名为Fr9B，其基因的核苷酸序列位于序列1中第13131-14213碱基处。本专利技术还提供了一个编码酰基转移酶的核苷酸序列，由序列4中的氨基酸序列组 成，命名为Fr9J，其基因的核苷酸序列位于序列1中第80014-80904碱基处。本专利技术还提供了一个编码3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)辅酶A合成酶的核苷酸 序列，由序列5中的氨基酸序列组成，命名为Fr9K，其基因的核苷酸序列位于序列1中第 80915-82204 碱基处。本专利技术还提供了一个编码烯醇辅酶A水合酶的核苷酸序列，由序列6中的氨基酸 序列组成，命名为Fr9L，其基因的核苷酸序列位于序列1中第82222-82977碱基处。本专利技术还提供了一个编码酰基载体蛋白的核苷酸序列，由序列7中的氨基酸序列 组成，命名为Fr9M，其基因的核苷酸序列位于序列1中第83053-83292碱基处。本专利技术还提供了一个编码酮基合成酶的核苷酸序列，由序列8中的氨基酸序列组 成，命名为Fr9N，其基因的核苷酸序列位于序列1中第83285-84550碱基处。本专利技术还提供了一个编码酰基转移酶的核苷酸序列，由序列9中的氨基酸序列组 成，命名为Fr90，其基因的核苷酸序列位于序列1中第84502-85695碱基处。本专利技术还提供了一个氧化酶的核苷酸序列，由序列10中的氨基酸序列组成，命名 为Fr9P，其基因的核苷酸序列位于序列1中第86029-87054碱基处。本专利技术还提供了一个细胞色素P450氧化酶的核苷酸序列，由序列11中的氨基酸 序列组成，命名为Fr9R，其基因的核苷酸序列位于序列1中第87831-89279碱基处。本专利技术还提供了一个乙酰基转移酶的核苷酸序列，由序列12中的氨基酸序列组 成，命名为Fr9S，其基因的核苷酸序列位于序列1中第89772-90230碱基处。本专利技术还提供了一个二鸟苷酸环化酶的核苷酸序列，由序列13中的氨基酸序列 组成，命名为Fr9T，其基因的核苷酸序列位于序列1中第91112-92515碱基处。本专利技术还提供了 一个包括 DH*-KR*-GT*-ACP-KS-KR-ACP-KS-ACP-ACP-TE-KS-ACP-C 聚酮合成酶结构域的核苷酸序列，由序列14中的氨基酸序列组成，命名为Fr9C，其基因的 核苷酸序列位于序列1中第14687-29872碱基处。本专利技术还提供了一个编码包括C-A-PCP-KS非核糖体聚肽合成酶和I型聚酮合成酶杂和结构域的核苷酸序列，由序列15中的氨基酸序列组成，命名为Fr9D，其基因的核苷 酸序列位于序列1中第29945-35257碱基处。本专利技术还提供了一个包括DH-KR-MT聚酮合成酶结构域的核苷酸序列，由序列16 中的氨基酸序列组成，命名为fr9E，其基因的核苷酸序列位于序列1中第35257-38823碱基 处。本专利技术还提供7 一个包括 ACP-ER-KS-DH-KR-ACP-KS-DH-KR-MT-ACP-KS 聚酮合成 酶结构域的核苷酸序列，由序列17中的氨基酸序列组成，命本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗肿瘤活性的天然产物ＦＲ９０１４６４的生物合成基因簇，该基因簇核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示，其特征在于包含编码ＦＲ９０１４６４生物合成所涉及的２０个基因，具体为： １）５个Ｉ型聚酮合成酶基因：ｆｒ９Ｅ，ｆｒ９Ｆ，ｆｒ９Ｇ，ｆｒ９Ｈ，ｆｒ９Ｉ； ２）杂合的聚酮／聚肽和非核糖体聚肽合成酶基因：ｆｒ９Ｃ，ｆｒ９Ｄ； ３）３个独立的酰基转运酶基因：ｆｒ９Ｂ，ｆｒ９Ｊ，ｆｒ９Ｏ； ４）４个与聚酮骨架烷基化相关基因：ｆｒ９Ｋ，ｆｒ９Ｌ，ｆｒ９Ｍ，ｆｒ９Ｎ； ５）４个后修饰基因：ｆｒ９Ｐ，ｆｒ９Ｑ，ｆｒ９Ｒ，ｆｒ９Ｓ； ６）２个转录调控相关基因：ｆｒ９Ａ，ｆｒ９Ｔ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐功利，张凤，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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