本发明专利技术属于猪基因工程技术领域，具体涉及一种猪肌肉特异表达基因MLC2启动子的克隆鉴定与应用。其步骤包括：提取“大白猪”肌肉组织总DNA，设计引物，PCR扩增获得猪MLC2基因5’端侧翼核苷酸序列(1704bp)，构建15个长度不同的MLC2启动子缺失片段的荧光素酶报告基因质粒，转染C2C12细胞，检测每个缺失片段的启动子的活性，鉴定获得猪MLC2基因的启动子。其中，猪MLC2基因启动子的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示(1704bp)，在所述的MLC2基因的启动子中还包含具有活性的15个启动子的片段，它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ?ID?NO：2-16所示。本发明专利技术为猪的遗传改良和转基因提供了重要的元件和手段，可强化猪转基因表达的肌肉组织特异性和稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于猪分子遗传学领域，具体涉及一种猪肌肉特异表达基因MLC2启动子的克隆鉴定与应用。
技术介绍
肌球蛋白(myosin)，又称ATP磷酸水解酶，作为一种分子马达作用于肌动蛋白(actin)，能有效地将高能磷酸化合物ATP分解释放的化学能转化为动能，为肌肉收缩、细胞物质运输和细胞分裂等提供动力，是肌肉组织中含量最高也是最重要的蛋白质，约占肌肉总蛋白质的1/3,占肌原纤维蛋白质的50% 55 为粗丝的主要成分(Vale andMilligan, 2000)。肌球蛋白是一个大分子六聚体，由I对重链(a -MHC, ^ -MHC)及2对轻链(MLC)组成。2对轻链分别为可磷酸化的调节轻链(Regulatory light chain或DTNB轻 链,LC2)和不可磷酸化的必需轻链(Essential light chain或碱性轻链，由LCl和LC2组成)，位于重链的头部(Trybus KM. The role of myosin light chains. J Muscle Res CellMotil, 1994，15 :587-594)。MLC2 (myosin light chain 2)编码肌球蛋白轻链2,是肌球蛋白的重要组分(肌球蛋白的凝聚状态以及热诱导时的凝胶特性对肉制品的质构、脂肪和水的结合能力等有很大影响)，对肌球蛋白的结构与功能显示重要调节作用，在肌肉的发生过程中起着调控重链表达的重要作用。MLC2属于肌钙蛋白C超家族，具有能与钙离子结合的EF臂结构域，能够可逆的由肌球蛋白轻链磷酸酯酶MLCP脱磷酸化和Ca2+/CaM依赖的肌球蛋白轻链激酶MLCK磷酸化，参与调节肌动蛋白与肌球蛋白互作、Ca2+敏感性、葡萄糖转运和影响肌肉性能的其他相关参数。另外，MLC2也是一种丝氨酸/苏氨酸激酶的底物，能被有丝分裂因子活化蛋白激酶(MAPK)激活，参与多种细胞信号途径。Davoli等(2003)已将其定位于猪的3号染色体短臂。徐德全等从杂交亲代大白猪与子代长大猪的背最长肌的消减cDNA文库中筛选到其EST，利用电脑克隆和SMART等技术，获得了其cDNA全长序列和全部内含子序列(GenBank登录号分别为 AY754870 和 AY870651, Xu et al. Identification of a differentialgene HUMMLC2B between Fl hybrids Landrace XYorkshire and their female parentsYorkshire. Gene,2005, 352 :118-126)。基因表达调控可以在复制、扩增、基因激活、转录、转录后、翻译和翻译后等多级水平上进行。但基因的转录起始是基因表达调控的基本控制点，最主要和最重要的调控发生在转录起始阶段(Trinklein et al. Identification and functional analysis ofhuman transcriptional promoters. Genome Res. 2003,13 :308-312)。而转录起始调控的实质是DNA-蛋白质/蛋白质-蛋白质间的相互作用对RNA聚合酶活性的影响，即通过影响相应的反式作用因子与顺式作用元件的相互作用，调控目的基因的表达。启动子是真核生物基因表达调控的顺式作用元件，含有基因表达调控网络的重要信息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它(Remenyi et al. Combinatorial control of geneexpression. Nat Struct Mol Biol. 2004,11 :812-815 ;Kim et al.Direct isolation andidentification of promoters in the human genome. Genome Res.2005,15 :830-839)。MLC2为肌肉特异表达基因。因此，分离克隆猪MLC2的启动子，研究其启动子的结构、功能和核心启动区的定位，是理解其基因表达调控机制及调控网络最基本、最重要的内容。利用其肌肉特异性启动子构建更有效的基因工程表达载体，可强化转基因表达的肌肉组织特异性和稳定性，应用于基因工程、育种工程等领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于分离克隆与鉴定猪肌肉特异表达基因MLC2的启动子，应用于猪遗传改良的基因工程和育种工程等领域。本专利技术克隆得到了猪MLC2基因5’端侧翼1704bp的序列(启动子)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。本专利技术通过以下技术方案实现 利用苯酚抽提法提取猪肌肉DNA，以猪MLC2基因的mRNA序列(AY754870)为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下引物正向引物MLCF 5' AGAAGGTGACCAGTTAGC 3'反向引物MLCR 5' CCTTTCCCATTAGTGATAC 3'利用该引物进行PCR扩增，克隆pMD18-T载体，提取质粒pMD18-T-MLC2，测序。利用生物信息学对该片段可能存在的转录因子结合位点进行分析，设计出15个长度不同的启动子缺失片段的扩增引物PGL3-PI 正向引物 5' CGAGCTCGAAGACCCGCCAGTG 3'PGL3-P2 正向引物 5' CGAGCTCTTTCACTTCTCCAGG 3'PGL3-P3 正向引物 5' CGAGCTCTTGCTTCTTAGGGCCAC 3'PGL3-P4 正向引物 5' CGAGCTCGCAGCCACCAGCCTA 3'PGL3-P5 正向引物 5' CGAGCTCAACCCGCATCCTCAT 3'PGL3-P6 正向引物 5' CGAGCTCGCAGCACAGCAGGAA 3'PGL3-P7 正向引物 5' CGAGCTCTTTCACCTGACTCGCTTC 3'PGL3-P8 正向引物 5' CGAGCTCCGCTTCTACTGGCCTTC 3'PGL3-P9 正向引物 5' CGAGCTCCCTTCTGTCCTCCTG 3'PGL3-P10 正向引物 5' CGAGCTCCCATGGCTAGACTATAATTT 3'PGL3-P11 正向引物 5' CGAGCTCCAAGTCCAAGGTCATA 3'PGL3-P12 正向引物 5' CGAGCTCTTCCTCACAAAATCCC 3'PGL3-P13 正向引物 5' CGAGCTCCGAATCGTACCCGTTA 3'PGL3-P14 正向引物 5' CGAGCTCCCCAGGTCCGAGTGA 3'PGL3-P15 正向引物 5' CGAGCTCCGGCCCTCCAAGAAA 3'反向引物(上述正向引物的共用引物) 5 ^ CCCAAGCTTCAAGGCAGTGGCTCT 3'然后以质粒pMD18-T-MLC2为模板，利用上述正向引物分别与反向引物配对进行PCR扩增，获得15个长度不同的MLC2启动子缺失片段。之后将15个缺失片段分别连接到pGL3-Basic载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)上，转染C2C12细胞(购自湖北省武汉市武汉大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离克隆的猪肌肉特异表达基因MLC2的启动子，其特征在于：该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种分离克隆的猪肌肉特异表达基因MLC2的启动子，其特征在于该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO I所不。2.如权利要求I所述的猪肌肉特异表达基因MLC2的启动子，其包含如下所示的启动子的...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐德全，刘敏，孙小瑞，夏晓亮，刘倩，熊远著，蒋思文，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。