一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，该方法用丹参SmWRKY70转录因子构建重组的植物表达载体，遗传转化丹参叶片获得转SmWRKY70基因的丹参毛状根。本发明专利技术从丹参中分离克隆出789bp的SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列；构建了SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体；构建了SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶片获得SmWRKY70基因的过表达丹参毛状根。采用本发明专利技术的方法获得的转基因丹参毛状根中丹参酮含量显著提高，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术，特别涉及一种利用代谢工程策略，转化丹参SmWRKY70转录因子提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。
技术介绍
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)，是一种多年生的双子叶草本植物，作为一种传统中药，丹参在临床上主要用于对心脑血管疾病的治疗。丹参中的有效成分主要包括两大类，一类是脂溶性的丹参酮类化合物，主要包括二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA等等；还有一类是水溶性的丹酚酸类化合物。大量研究已经证明，丹参酮具有多种药理活性，分别是心脑血管保护、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，因此具有巨大的市场需求。但是，在传统的栽培模式下，丹参生长周期较长、品质严重退化的弊端；而在化学合成过程中，由于丹参酮的结构复杂导致其化学合成过程十分繁琐，成本较高且易造成环境污染；在离体条件下的细胞培养方法获得的细胞，其药用活性成分积累量很低而且稳定性很差，远达不到商业化开发利用的要求。代谢工程的迅速发展与毛状根培养技术的日益成熟为提高丹参毛状根中丹参酮成分的含量，解决丹参酮药源紧缺性问题提供了一条新思路。据文献检索分析，WRKY转录因子是植物界中最大的一类转录因子之一，是调控许多植物过程信号网络必不可少的部分。WRKY转录因子最显著的特征是其DNA结合域中都至少含有1个WRKY结构域。WRKY蛋白参与植物的许多生理过程，主要包括：生物胁迫、非生物胁迫、种子的形成、种子的休眠与萌发、植物的衰老和发育。利用代谢工程手段，将丹参SmWRKY70转录因子转化丹参，获得高产丹参酮的丹参毛状根，为商业化生产丹参酮提供新型优质药源，目前尚未发现与本专利技术主题所提及的利用丹参SmWRKY70转录因子提高丹参毛状根中丹参酮含量的相关报道。因此，本专利技术在实际解决丹参酮药源紧缺性的问题上具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的，在于克服现有技术的不足，提供一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术从丹参中分离克隆出789bp的SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列；构建了SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，激光共聚焦显微镜观察显示SmWRKY70转录因子在细胞核中表达；构建了SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶片获得SmWRKY70基因的过表达的转基因丹参毛状根，QRT-PCR分析转基因丹参毛状根中SmWRKY70以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达，高效液相色谱法(HPLC)测定转基因丹参毛状根中丹参酮的含量。本专利技术包括如下具体步骤：(1)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序列，将丹参SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基因的过表达载体；所述的丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQ ID NO.1所示；植物表达载体为经过改造获得的pCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。(2)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所述丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQ ID NO.2所示。(3)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT-PCR引物，对丹参SmWRKY70转录因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析。(4)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，对丹参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析。(5)将步骤(1)所获得的SmWRKY70转录因子的植物过表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1。(6)将步骤(5)所获得的含SmWRKY70转录因子的植物过表达载体的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根；所述的经PCR检测的阳性转基因丹参毛状根是指：在驱动插入基因(SmWRKY70)表达的组成型启动子CaMV35S的内部及插入基因SmWRKY70的内部，分别设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因丹参毛状根株系。(7)QRT-PCR分析步骤(6)获得的经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根中SmWRKY70基因的表达，筛选出过表达SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表达量提高的株系；QRT-PCT分析转基因丹参毛状根中SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达，具体方法为：对经PCR鉴定为阳性的转基因丹参毛状根克隆进行总RNA的提取，并反转录成cDNA，分别设计检测基因及看家基因Actin的引物，进行QRT-PCR扩增，分析SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达情况。(8)用高效液相色谱法(HPLC)测定步骤(7)获得的过表达SmWRKY70基因株系中丹参酮的含量，筛选丹参酮含量提高的转基因丹参毛状根株系；对SmWRKY70基因的表达量显著提高的转基因丹参毛状根中丹参酮的含量进行高效液相色谱法测定的具体测定方法如下：将丹参酮粗提物各取20μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈：水(65：35，柱温为30℃，流速为1mL/min，检测波长为220nm。本专利技术应用常规生物学实验方法如载体构建、遗传转化、分子检测、定量QRT-PCR分析、丹参酮提取及含量测定等，建立了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。采用遗传转化丹参SmWRKY70转录因子基因的代谢工程策略获得了高产丹参酮的丹参转基因毛状根株系，所获得的转基因丹参毛状根中总丹参酮含量显著提高，其中总丹参酮含量最高的一个克隆为W70-03(13.731mg/g)，是对照组(2.175mg/g)的6.31倍。本专利技术提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，为商业化大量生产丹参酮和降低药品价格提供了可能，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用，也为规模化生产丹参酮临床药物的大量需求提供了重要来源。附图说明图1为pCAMBIA2300+::SmWRKY70载体构建图。图2为SmWRKY70启动子序列。图3为SmWRKY70在不同组织中的表达情况。图4为SmWR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序列，将丹参SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基因的过表达载体；所述的丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQ ID NO.1所示；(2)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所述丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQ ID NO.2所示；(3)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT‑PCR引物，对丹参SmWRKY70转录因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析；(4)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，对丹参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析；(5)将步骤(1)所获得的SmWRKY70基因的过表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；(6)将步骤(5)所获得的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根；(7)QRT‑PCR分析步骤(6)获得的经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根中SmWRKY70基因的表达，筛选出过表达SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表达量提高的株系；(8)用高效液相色谱法测定步骤(7)获得的过表达SmWRKY70基因株系中丹参酮的含量，筛选丹参酮含量提高的转基因丹参毛状根株系。...

【技术特征摘要】
1.一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序
列，将丹参SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基
因的过表达载体；所述的丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所
述丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT-PCR引物，对丹参
SmWRKY70转录因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析；
(4)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转
化烟草，对丹参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析；
(5)将步骤(1)所获得的SmWRKY70基因的过表达载体转化发根农杆菌，
获...

【专利技术属性】
技术研发人员：开国银，李磊磊，郝小龙，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31