检测FII基因3’UTR序列的引物和方法技术

本发明专利技术公开了检测FII基因3’UTR突变位点的引物和方法，所述引物包括扩增覆盖FII基因3’UTR端序列的正、反向引物和测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述测序引物可用于快速检测静脉血栓患者的FII基因3’UTR序列的突变情况，其中包含了位于3’UTR的主要突变位点G20210A。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测FII基因3’UTR序列的引物和方法。
技术介绍
易栓症是由于抗凝蛋白、凝血因子、纤溶蛋白等遗传性或获得性缺陷或存在获得性危险因素而容易发生血栓栓塞的状态，主要临床表现类型为静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism，VTE)。易栓症可分为遗传性易栓症与获得性易栓症，遗传性危险因素目前主要有：凝血因子V(factor V，FV)Leiden变异、蛋白C(PC)缺乏、蛋白S(PS)缺乏，凝血酶原G20210A(FIIG20210A)基因变异、抗凝血酶(AT)缺乏，高同型半胱氨酸血症等。凝血酶原(prothrombin，PT)即凝血因子II(FII)是最早被提纯和测定氨基酸顺序的凝血因子。凝血酶原基因位于第11号染色体，基因长21kb，有14个外显子和13个内含子编码，其mRNA为2kb，合成622个氨基酸的肽链，其中前导肽43个氨基酸，在分泌过程中裂解。1996年，Poort等报道PT基因3’端未转录区20210位核苷酸G→A的变异在首次血栓患者中的发生率为6.2％，健康人群中的发生率为2.3％，PT基因G20210A变异的杂合体静脉血栓形成的危险较正常人增加2.8倍。研究表明，凝血酶原基因(FII)3’端非翻译区第20210位核苷酸G→A的突变与血浆凝血酶原水平的增高有关，凝血酶原水平增高可使活化蛋白C(APC)的抗凝作用减弱，抑制APC灭活FVa的速度，产生活化蛋白C抵抗(APCR)，使血栓形成的风险加大。蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等均被应用于FII基因突变的检测,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。由于FII基因容量大、突变类型多、突变率高、突变位点散在分布,故而阻止了对FII基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。
技术实现思路
本专利技术提供检测FII基因3’UTR序列的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测静脉血栓患者体内FII基因3’UTR序列突变的情况。扩增覆盖检测FII基因3’UTR序列突变的正向引物(20210-F)和反向引物(20210-R)的碱基序列为：20210-F：5'-GCACAGACGGCTGTTCTCTT-3'20210-R：5'-ATAGCACTGGGAGCATTGACGC-3'。进一步地，所述引物还包括正向测序引物(20210-F)和反向测序引物(20210-R)，其碱基序列为：20210-F：5'-GCACAGACGGCTGTTCTCTT-3'20210-R：5'-ATAGCACTGGGAGCATTGACGC-3'。进一步地，所述扩增的正、反向引物的使用浓度比为：20210-F：20210-R＝1:1。进一步地，所述测序的正反向引物的使用浓度比为：20210-F：20210-R＝1:1。本专利技术的目的还在于提供一种检测FII基因3’UTR序列的方法，其包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)利用扩增引物20210-F与20210-R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测FII基因3’UTR序列突变的扩增产物；(3)利用测序引物20210-F与20210-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与野生型FII基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。本专利技术的目的还在于提供一种检测FII基因3’UTR序列的试剂盒，包括样品DNA抽提试剂、无水乙醇、检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括扩增引物20210-F与20210-R，测序体系包括测序引物20210-F与20210-R，引物序列为：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs、KOD FX DNA Polymerase。进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、和HIDI。进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。本专利技术设计了扩增覆盖检测FII基因3’UTR序列的正、反向引物，以及对所获得的扩增产物进行正反向测序的测序引物。对送检样本进行PCR扩增，采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测FII基因3’UTR序列的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。有益效果：利用本专利技术所述扩展引物和测序引物，可以扩展整个3’UTR序列，通过测序结果的分析，可以很直观地了解FII基因3’UTR序列的基因突变情况，并不受FII基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。FII突变情况的检测对静脉血栓栓塞症有重要意义。附图说明图1为FII基因在染色体上定位图图2为20210-F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-24为送检的患者血液样本1-24号，如图2所示，引物20210-F/R扩增有效，且条带单一。图3、4、5、6、7、8分别为样本3、5、6FII基因3’UTR的正、反向的测序截图。其中方框内为FII基因3’UTR G20210A的位置，图中测序结果显示这些样品均未发生突变。图9为样品3的整个3’UTR序列测序图。具体实施方式下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本专利技术。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例1检测FII基因3’UTR序列的引物，包括：扩增覆盖检测FII基因3’UTR序列的正、反向引物；所述扩增引物的碱基序列为：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。在检测中，先利用上述正、反向引物对FII基因3’UTR序列的DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的序列两侧，即扩增区域包括了该序列的全部序列。虽然FII基因在静脉血栓患者中有较为主要的突变位点G20210A(在3’UTR序列上)，但不明确的突变位点也很多，突变类型不定。因此本专利技术所述引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来，也保证无论3’UTR序列的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。检测FII基因3’UTR序列的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测FII基因3’UTR序列的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖FII基因3’UTR序列的正向引物和反向引物，其碱基序列为：20210‑F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210‑R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。

【技术特征摘要】
1.检测FII基因3’UTR序列的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖FII基因3’UTR序列的正向引物和反向引物，其碱基序列为：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括正向测序引物和反向测序引物，其碱基序列为：20210-F：5'GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3'20210-R：5'ATAGCACTGGGAGCATTGACGC 3'。3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正向引物和反向引物的使用浓度比为：20210-F：20210-R＝1：1。4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正向测序引物和反向测序引物的使用浓度比为：20210-F：2021...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘赵玲，单战，王淑一，
申请(专利权)人：南京艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32