一种用于检测HLA-B*1502等位基因的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测HLA‑B*1502等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针,包含两对根据HLA‑B*1502特异性序列设计的引物及相应两条探针，还包含一对用于筛除HLA‑B*1502假阳性的引物及相应一条探针，还包含一对内对照引物及相应一条探针。本发明专利技术具有如下技术效果：通过两个反应管确定实验样本HLA‑B*1502基因阳性与否，通过一个反应管排除HLA‑B*1502基因的假阳性结果，通过每个反应孔添加的内对照引物及探针排除样本HLA‑B*1502基因的假阴性结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于检测HLA-B*1502等位基因的方法和试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。
技术介绍
药物基因组学(pharmacogenomics)又称为基因组药物学或基因组药理学，是药理学的一个分支，定义为在基因组学的基础上，通过将基因表达或单核苷酸的多态性与药物的疗效或毒性联系起来，研究药物如何由于遗传变异而产生不同的作用。简而言之，药物基因组学致力于研究个体基因结构对药物反应的影响，发现关联基因及其作用机制和功能，并应用于临床疾病诊断和确定给药剂量。基因研究资料与临床实践结合可有助于更精确的掌握病人概况，选择最优化治疗方案，进一步帮助对易发生药品不良反应(Adverse Drug Reactions,ADRs)病人的鉴别。大量基因学研究数据现已运用于药物反应和疾病易感性的预测，美国食品药品监督管理局(FDA)已公布百余种药物与特异性基因的相关性资料，其中一些基因检测已在世界范围内应用于常规临床诊治。例如，美国FDA批准对拟采用易瑞沙(Gefitinib)、特罗凯(Erlotinib)等表面生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)类肿瘤靶向治疗药物的患者，进行EGFR酪氨酸激酶基因突变检测；细胞色素P450 2D6(CYP2D6)基因突变检测也被包含在多种抗精神病药物的标签上。ADR是指在按规定剂量正常应用药品的过程中产生的与治疗无关的作用，而这种作用一般是有害的，且与药品应用有因果关系，可表现出多种临床症状和体征，并可由多种结构不同的化合物引发。过敏反应由于其症状严重性、高入院率和高死亡率已成为国家医药卫生系统的负担，并成为ADR中受主要关注的一种。药物过敏反应可表现为轻型斑丘疹爆发(Maculopapular Eruption，MPE)，也可表现为更加危险甚至致命的重症皮肤不良反应(Severe Cutaneous Adverse Reactions,SCAR)，包括史蒂芬琼森症候群(Stevens Johnson Syndrome，SJS)、毒性表皮坏死松懈症(Toxic Epidermal Necrolysis，TEN)和过敏反应综合征(Hypersensitivity Syndrome,HSS)。MPE主要表现为细小的粉色斑丘疹，并可在停止用药后1-2周消退。HSS表现为多器官综合征，除发生皮疹外，伴有多系统损害，如发热、关节痛、嗜酸性粒细胞增多和淋巴结病变；SJS以发热、乏力、迅速进展的泡状斑疹和粘膜病变为特征；TEN的症状与SJS相似，但更为严重，死亡率更高。虽然SJS/TEN的发病率极低，每年大约有1,000,000分之0.4至6个个案，但其死亡率高达5-50％，并且存活的SJS/TEN患者约有30-70％患有严重后遗症。SJS/TEN可由病毒感染、肺炎霉浆菌感染、遗传等多种因素引起，但最常见的起因为药物治疗，约占80％。SCAR的发病机制尚不清楚，普遍认为是多因素的，包括遗传因素。同时，以往的研究证明免疫机制在多种ADR的进展中发挥着重要作用。因此，基因变异在高度多态性的人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)系统中的作用引起了研究者的高度关注。HLA位于人类6号染色体短臂的21.31区，约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域，分为HLA-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因。经典的HLA-Ⅰ类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三类，经典的Ⅱ类基因一般指DR、DP和DQ，HLA-Ⅲ类基因与前两类不同，除包含肿瘤坏死因子(Tumour Necrosis Factor，TNF)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)基因、热休克蛋白基因等具有免疫相关功能的基因外，还包括许多非免疫相关基因。其中，HLA-B是人类基因组中最具多态性的区域，包含超过1600个等位基因。研究报道，HLA与多种疾病密切相关，如强直性脊柱炎、贝赛特氏症、乳糜泻等。近年来，HLA在药物基因组学研究中的重要作用引起广泛关注，国内外多个课题组通过对临床病例的基因检测，发现特定的HLA等位基因与多种药物过敏反应高度相关。其中，最典型的应用为美国FDA明确建议亚裔病人在服用卡马西平(carbamazepine)前进行HLA*B1502基因检测。此外，阿巴卡韦(abacavir)、别嘌呤醇(allopurinol)等引起的SCAR与特异性HLA等位基因的密切关系也得到明确报道。卡马西平是临床精神科常用的一线抗癫痫药物，但也是引发皮肤不良药物反应(cutaneous Adverse Drug Reactions，cADRs)的较常见因素。卡马西平可引起MPE，也可导致SCAR，其中MPE症状较轻，可自行消退，而SCAR症状严重，死亡率较高。研究发现，在中国汉族人群中，HLA*B1502基因阳性患者服用卡马西平可导致SJS/TEN。随后，在泰国、马来西亚和印度等亚洲人群中也确认了卡马西平与HLA*B1502基因间的高度相关性。此外，在中国汉族人群和泰国人群中还发现了另一种抗癫痫药物——苯妥英(phenytoin)与HLA*B1502基因的密切相关性。由此，美国FDA明确建议亚裔人群在服用卡马西平、苯妥英等抗癫痫药物前，应进行HLA*B1502基因检测。由此可见，快速而准确地检测HLA*B1502等位基因对临床个体化治疗、医学研究及新药开发和评价具有重要意义。目前国内市场上常用的上述基因检测方法主要有PCR-SSP法、PCR-SSOP法、SYBR Green I及Taqman荧光定量PCR法等。PCR-SSP(sequence specific primer)即序列特异引物引导的PCR反应，是目前被广泛采用的检测方法，其基本方法是设计一系列等位基因型特异性引物，通过特定PCR反应体系扩增各等位基因型特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，此方法成本低，但操作复杂，无法自动获取结果，准确度也有待提高。PCR-SSOP即多聚酶链反应寡聚核苷酸探针杂交，先采用位点特异性引物对HLA-B位点进行扩增，扩增产物包括HLA-B位点的所有等位基因序列，再根据碱基互补原则，将PCR产物经化学变性解链后，单链与固化在2条尼龙膜上的序列特异寡核苷酸探针在特定条件下杂交，经洗膜，加入标记有碱性磷酸盐的抗生物蛋白链菌素与生物素及底物反应，对扩增片段进行分析鉴定。SSOP反向杂交法操作繁琐，耗时长，需严格控制实验条件，否则会导致错配，影响结果准确性。荧光定量PCR的基本原理是在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，从而对PCR产物进行实时检测。SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。Taqman荧光定量PCR法克服了以上不足，操作简便、快速，特异性高，并可实现高通量检测。一般来讲，Taqman荧光定量PCR法通过设计一对或多对HLA-B*1502特异性引物及相应探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测HLA‑B*1502等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，其特征在于，所述的PCR扩增引物组和Taqman探针包含两对根据HLA‑B*1502特异性序列设计的引物及相应两条探针，序列如下：名称序列引物15’‑CGAGTCCGAGGATGGC‑3’引物25’‑TCTGTGTGTTGGTCTTG‑3’探针15’‑TGTTGCGGTCCCAATAC‑3’引物35’‑CATCATCCAGAGGATGT‑3’引物45’‑TGCGGTCGTATGAGGA‑3’探针25’‑TACACGCGGATGAGGC‑3’所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对用于筛除HLA‑B*1502假阳性的引物及相应一条探针，序列如下：名称序列引物55’‑CCGGAACACACAGATCT‑3’引物65’‑CTCTGGTTGTAGTAGCCG‑3’探针35’‑CGATCGGCAGGTTCTCT‑3’所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对内对照引物及相应一条探针，用于监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果，序列如下：

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HLA-B*1502等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，其特征在于，所述的PCR扩增引物组和Taqman探针包含两对根据HLA-B*1502特异性序列设计的引物及相应两条探针，序列如下：名称序列引物15’-CGAGTCCGAGGATGGC-3’引物25’-TCTGTGTGTTGGTCTTG-3’探针15’-TGTTGCGGTCCCAATAC-3’引物35’-CATCATCCAGAGGATGT-3’引物45’-TGCGGTCGTATGAGGA-3’探针25’-TACACGCGGATGAGGC-3’所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对用于筛除HLA-B*1502假阳性的引物及相应一条探针，序列如下：名称序列引物55’-CCGGAACACACAGATCT-3’引物65’-CTCTGGTTGTAGTAGCCG-3’探针35’-CGATCGGCAGGTTCTCT-3’所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对内对照引物及相应一条探针，用于监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈炤源，王浩，张金涛，章婷婷，
申请(专利权)人：江苏伟禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32