一种TaqDNA聚合酶突变体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法。本发明专利技术所述的Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术采用现代基因工程技术，将野生型Taq酶氨基酸序列中的多个位点的氨基酸进行同时突变，并经重组表达后得到突变型Taq酶。该突变型Taq酶与未经改造的野生型Taq酶相比，上述定点突变使得酶的扩增速度有较大的提高。本发明专利技术的Taq DNA聚合酶突变体具有如下技术效果：本发明专利技术的Taq DNA聚合酶突变体可以用更少的时间完成PCR反应，PCR扩增效率更高，且在相同条件下使用本发明专利技术突变型Taq酶扩增，CT值更小。CT值更小。CT值更小。

【技术实现步骤摘要】
一种Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法，属于生物


技术介绍

[0002]Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，最初由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌(thermus aquaticus)中提取获得，Taq酶的分子量为94kDa，可以催化5'至3'方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合，Taq酶没有3'至5'的外切酶活性。此酶能耐高温，在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列测定并可利用聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)对DNA的特定片段进行体外扩增。Taq DNA聚合酶热在PCR过程中循环高温条件下仍可保持较高的酶活，具有良好的行进性。
[0003]聚合酶链式反应法(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种分子生物学常用技术，由于其可以特异性地扩增极其微量的DNA，目前已经广泛应用于临床病原微生物以及疾病的诊断、法医学鉴定、环境监督、食品药品真伪鉴定等。常规PCR技术依靠热循环仪的升降温，使模板DNA序列经过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤，完成对目标序列的一次扩增，通过20
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40次的反复扩增，可以实现对微量DNA的指数型扩增。
[0004]随着技术的进步，人们对Taq DNA聚合酶的性能产生更高的要求，如提高Taq DNA聚合酶的扩增速度效率，缩短PCR反应时间等方面。因此需要对野生型Taq DNA聚合酶进一步改造，以满足我们的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法。
[0006]专利技术人意外地发现，将野生型Taq DNA聚合酶，第732位的天冬氨酸突变为天冬酰胺(突变后聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示)，能够提高Taq DNA聚合酶的性能，提高Taq DNA聚合酶的扩增速度效率，缩短PCR反应时间。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种Taq DNA聚合酶突变体，所述的Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]在本专利技术的第二方面，提供了一种核酸，所述核酸编码如第一方面所述的Taq DNA聚合酶突变体，所述的核酸具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
[0009]在本专利技术的第三方面，一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如第二方面所述的核酸。
[0010]进一步地，所用的载体为PET21a，酶切位点XbaI和XhoI。
[0011]在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述的重组表达载体或如第二方面所述的核酸。
[0012]进一步地，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态。
[0013]在本专利技术的第五方面，提供了制备如第一方面所述Taq DNA聚合酶突变体的方法，
包括：在适于Taq DNA聚合酶突变体表达的条件下，培养如第四方面所述的宿主细胞，从培养的宿主细胞中分离获得所述Taq DNA聚合酶突变体。
[0014]在本专利技术的第六方面，提供了如第一方面所述Taq DNA聚合酶突变体在扩增DNA样本中的应用。
[0015]在本专利技术的第七方面，提供了一种PCR扩增试剂盒，含有如第一方面所述Taq DNA聚合酶突变体。
[0016]本专利技术采用现代基因工程技术，将野生型Taq酶氨基酸序列中的多个位点的氨基酸进行同时突变，并经重组表达后得到突变型Taq酶。该突变型Taq酶与未经改造的野生型Taq酶相比，上述定点突变使得酶的扩增速度有较大的提高。
[0017]本专利技术的Taq DNA聚合酶突变体具有如下技术效果：
[0018]本专利技术的Taq DNA聚合酶突变体可以用更少的时间完成PCR反应，PCR扩增效率更高，且在相同条件下使用本专利技术突变型Taq酶扩增，CT值更小。
[0019]从具体实施方式中的图2可以看出：在相同条件下，突变型Taq DNA酶b
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1(即本专利技术)扩增效果明显较好；从图3可以看出：扩增3kb片段时，突变型Taq酶b
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1在延伸时间2min与野生型Taq酶延伸时间3min的条件下扩增结果相当；突变型Taq酶b
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1在延伸时间3min时扩增条带最亮；从图4可以看出：在相同条件下使用突变型Taq酶b
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1扩增的CT值更小。
附图说明
[0020]图1为本申请中检测Taq DNA聚合酶的SDS
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PAGE蛋白电泳图。
[0021]图2为本申请中常规PCR检测三种突变型Taq酶和野生型Taq酶扩增情况对比图。
[0022]图3为本申请中常规PCR检测突变型Taq酶b
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1与野生型Taq酶不同延伸时间扩增情况对比图。
[0023]图4为本申请中荧光定量PCR检测三种突变型Taq酶和野生型Taq酶扩增情况对比图。
具体实施方式
[0024]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0025]本专利技术中，涉及的实验材料的购买来源说明如下：
[0026]引物合成：通用生物提供
[0027]BL21(DE3)感受态细胞，LB培养基，PMSF，IPTG，BufferA,B,C，Ni
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凝胶，Washing Buffer，Binding buffer，透析膜，透析袋夹子，SDS
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PAGE凝胶快速制备试剂盒，Mark：均购自上海生工
[0028]Q5 Hot Start DNA Polymerase，XbaI和XhoI酶：购自NEB
[0029]PET21a商业载体：购自赛索飞
[0030]50ml离心式蛋白纯化柱：购自逗点生物
[0031]实施例1
[0032]根据野生型Taq酶氨基酸序列(Genebank D32013.1)和需要突变的位点合成突变
引物，进行PCR扩增。扩增后，通过分子克隆技术将PCR产物连接到载体PET21a中，然后转化到感受态细胞中。挑单克隆进行菌液培养和质粒抽提测序，测序正确后该质粒即是需要的含突变型酶基因的质粒。
[0033]1、Taq酶序列的定点突变
[0034]本专利技术选取3种突变型Taq DNA聚合酶，分别为突变型b
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1(第732位的天冬氨酸突变为天冬酰胺)，突变型b
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2(第460位的丝氨酸突变为脯氨酸)，突变型b
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3(第495位的苯丙氨酸突变为苏氨酸)。
[0035]突变位点信息如下：
[0036][0037][0038]突本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述的Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体，所述的核酸具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求2所述的核酸。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所用的载体为PET21a，酶切位点XbaI和XhoI。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求3或4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈炤源，王浩，章婷婷，崔江应，
申请(专利权)人：江苏伟禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：