【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测hla-dpb1基因分型的引物组及试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。
技术介绍
1、hla位于人类6号染色体短臂的21.31区，约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域，分为hla-ⅰ、ⅱ和ⅲ类基因。经典的hla-ⅰ类基因包括hla-a、hla-b和hla-c三类，经典的ⅱ类基因一般指dr、dp和dq，hla-ⅲ类基因与前两类不同，除包含肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，tnf)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，lta)基因、热休克蛋白基因等具有免疫相关功能的基因外，还包括许多非免疫相关基因。hla系统在抗原识别与呈递、免疫应答与调控等方面起着极其重要的作用，是影响器官移植物长期存活和造血干细胞移植成败的关键因素之一，hla与多种疾病密切相关，如强直性脊柱炎、类风湿关节炎、贝赛特氏症、乳糜泻等。
2、快速而准确地检测hla-dpb1基因分型对临床疾病辅助诊断、医学研究及疾病病因学研究等具有重要意义。目前常用的hla-dpb1基因分型的检测方法主要有pcr-ssp法、sybrgreen i、taqman荧光定量pcr法、测序法等。各方法的特点如下：
3、pcr-ssp(sequence specific primer)即序列特异引物引导的pcr反应，是目前被广泛采用的检测方法，其基本方法是设计一系列等位基因型特异性引物，通过特定pcr反应体系扩增各等位基因型特异性dna片段，产生相对应的特异性扩
4、sybr greenⅰ是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与dna的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。
5、taqman荧光定量pcr法虽然操作简便快速，但无法实现高分辨的分型结果。
6、测序法可以获得高分辨结果，但目前应用不广。
7、可以看出，只有测序法可以获得高分辨的分型结果，但首先需要设计特异性的扩增引物，进行pcr扩增，考虑到hla多态性非常高，结果易出现假阳性，从而影响其准确性。现有的中国专利申请cn201910952019.9，公开了一组引物以及hla-dpb1基因测序分型的检测方法，包括2对特异性扩增引物和5条寡核苷酸测序引物。该方法包括pcr扩增、电泳检测pcr产物、pcr产物纯化、测序反应、测序产物醋酸钠-乙醇沉淀法纯化、上机测序和数据分析步骤。但是此方法中，仅对外显子进行测序，有较多基因型别无法区分开。
8、因此，本领域急需一种操作简便、快速，且准确度高的检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于检测hla-dpb1基因分型的引物组及试剂盒。
2、本专利技术的引物组设计思路如下：根据已知人类白细胞抗原基因序列，应用扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，arms)分析法结合双错配特异碱基法，设计hla-dpb1基因特异性扩增引物。当引物序列与待测目标序列能完全匹配时，进行聚合酶链式(polymerase chain reaction,pcr)反应。在反应过程中，目标核酸片段将被复制与放大，说明在样本中存在与特异性引物完全相同的基因序列，反之则否。利用琼脂糖凝胶电泳法对pcr反应结果进行检测分析。当电泳胶经染色后通过凝胶成像系统分析，核酸片段会因大小不同而被区分开来。经过电泳初步鉴定的反应扩增物会被纯化进行下一步的测序分析以鉴定各个等位基因的序列，从而实现对hla-dpb1的高分辨基因分型。
3、hla约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域。普通的引物设计方法对于区分hla基因亚型存在一定局限性，准确性不高。专利技术人首次使用了arms结合双错配特异碱基的引物设计方法，首先于数据库中找到dpb1基因的特异性碱基序列，上游特异性扩增引物位于1号内含子末尾端，下游特异性扩增引物位于4号内含子前端，从而在第一步准确特异的扩增出dpb1基因2号外显子、2号内含子、3号外显子、3号内含子、4号外显子，扩增效率高。并且，根据初步检测结果，在引物上又引入了一个错配碱基，提高了引物的特异性。该方法准确性高，操作简便，具有广阔的应用前景。
4、在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测人类白细胞抗原hla-dpb1基因分型的引物组，包含1对根据dpb1基因特异性序列设计的长片段扩增引物，对应6条外显子测序引物、2条特异性单链测序引物和5条特异性内含子测序引物。
5、所述的特异性pcr扩增引物是1对根据hla-dpb1基因特异性序列设计的长片段扩增引物。所述的扩增引物能够准确特异地扩增dpb1基因2号外显子、2号内含子、3号外显子、3号内含子、4号外显子，用于特异性扩增dpb1所有亚型。
6、所述的1对特异性pcr扩增引物的核苷酸序列如下表所示：
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8、本专利技术的pcr扩增引物，是根据改良的扩增阻碍突变系统(amplificationrefractory mutation system，arms)分析法，结合双错配特异性碱基法，设计特异性引物，所述的正向扩增引物和反向扩增引物的3’端均是dpb1基因特异性碱基，并且在引物上额外引入一个错配碱基，提高了检测的特异性。
9、本专利技术的用于检测hla-dpb1基因分型的引物组，还包括6条外显子测序引物、2条特异性单链测序引物和5条特异性内含子测序引物，共13条测序引物。
10、所述的13条测序引物，每个引物核苷酸序列如下表所示：
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13、本专利技术的测序引物中，6条外显子测序引物为dpb1基因特异性的常规测序引物，2条特异性单链测序引物为dpb1基因特异性的单链测序引物，再结合和5条特异性内含子测序引物，能够对dpb1基因2/3/4号外显子进行高分辨测序，对2/3号内含子进行高分辨测序，并可以进行2号外显子特异性单链测序。能够更准确的分辨出样本的dpb1基因型别，减少模棱两可的情况。
14、在本专利技术的第二方面，提供了如第一方面所述的用于检测人类白细胞抗原hla-dpb1基因分型的引物组在制备检测hla-dpb1基因分型的试剂盒中的应用。
15、在本专利技术的第三方面，提供了含有如第一方面所述的用于检测人类白细胞抗原hla-dpb1基因分型引物组的试剂盒，所述的试剂盒中还包括pcr反应试剂。
16、进一步地，所述的pcr反应试剂包括pcr反应液和高保真taq酶。
17、进一步地，所述的pcr反应液包括：0.5mm脱氧核苷酸dntp，40mm氯化镁mgcl2，80mm氯化钾kcl，60mm三羟甲基氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测HLA-DPB1基因分型的引物组，其特征在于，所述的引物组包含1对根据HLA-DPB1基因特异性序列设计的长片段扩增引物，所述引物的核苷酸序列如下表所示：
2.如权利要求1所述的用于检测HLA-DPB1基因分型的引物组在制备检测HLA-DPB1基因分型的试剂盒中的应用。
3.含有如权利要求1所述的用于检测HLA-DPB1基因分型的引物组的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂包括PCR反应液和高保真Taq酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液包括：0.5mM脱氧核苷酸dNTP，40mM氯化镁MgCl2，80mM氯化钾KCl，60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl，1mM四甲基氯化铵TMAC，甘油0.6％v/v，甲酚红0.02％v/v和甜菜碱5％v/v。
6.采用如权利要求1所述的用于检测HLA-DPB1基因分型的引物组进行非疾病诊断目的的检测HLA-DPB1基因分型的方法，所述的方法包
7.根据如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的扩增反应体系为：12.4μL，包括PCR反应液6μL，酶0.4μL，扩增引物混合液3μL，DNA模板3μL；所述的PCR扩增反应，其反应程序为95℃2分钟；93℃10秒、68℃5分，30个循环；72℃5分，4℃直到取出。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测hla-dpb1基因分型的引物组，其特征在于，所述的引物组包含1对根据hla-dpb1基因特异性序列设计的长片段扩增引物，所述引物的核苷酸序列如下表所示：
2.如权利要求1所述的用于检测hla-dpb1基因分型的引物组在制备检测hla-dpb1基因分型的试剂盒中的应用。
3.含有如权利要求1所述的用于检测hla-dpb1基因分型的引物组的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括pcr反应试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的pcr反应试剂包括pcr反应液和高保真taq酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的pcr反应液包括：0.5mm脱氧核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：王浩，章婷婷，崔江应，陈炤源，
申请(专利权)人：江苏伟禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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