一种快速长片段扩增酶及其在KIR基因测序中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种快速长片段扩增酶及其在KIR基因测序中的应用。所述的快速长片段扩增酶为经氨基酸序列修饰的可快速扩增长片段的DNA聚合酶，所述的修饰的DNA聚合酶与未修饰的DNA聚合酶的氨基酸序列相比，进行如下突变：第145位的亮氨酸L突变为谷氨酰胺Q，第719位的缬氨酸V突变为天冬酰胺N，所述快速长片段扩增酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 48所示。本发明专利技术具有如下技术效果：1）本发明专利技术的DNA聚合酶为经氨基酸序列修饰的可快速扩增长片段的DNA聚合酶，能够实现对长片段目的序列的快速准确扩增；可在一个PCR反应实现对KIR亚型基因的全长扩增，长至16kb；2）能够实现对样本KIR基因的快速扩增及测序分型。基因的快速扩增及测序分型。基因的快速扩增及测序分型。

A rapid long fragment amplification enzyme and its application in KIR gene sequencing

【技术实现步骤摘要】
一种快速长片段扩增酶及其在KIR基因测序中的应用


[0001]本专利技术涉及一种快速长片段扩增酶及其在KIR基因测序中的应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)来源于骨髓淋巴样干细胞，其发育成熟依赖于骨髓和胸腺微环境。NK细胞主要分布于外周血和脾，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。NK细胞不表达特异性抗原识别受体，是不同于T、B淋巴细胞的一类淋巴样细胞。NK细胞可表达多种表面标志，其中多数也可表达于其他免疫细胞表面。NK细胞属于非特异性免疫细胞，它们无需抗原预先致敏，就可直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞，因此在机体抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中起重要作用。NK细胞能够杀伤某些病毒感染的细胞和突变的肿瘤细胞，而对宿主正常组织细胞下不具细胞毒作用，表明NK细胞具有识别宿主自身正常组织细胞和体内异常组织细胞的能力。近年来研究证实，NK细胞表面具有两类功能截然不同的受体，其中一类受体与靶细胞表面相应配体结合后，可激发NK细胞产生杀伤作用，称为杀伤细胞活化受体；另一类受体与靶细胞表面相应配体结合后，可抑制NK细胞产生杀伤作用，称为杀伤细胞抑制受体。NK细胞识别HLA I类分子的受体由两种结构不同的家族分子构成。一种称之为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin
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like receptor,KIR)；另一种称之为杀伤细胞凝集素样受体(killer lectin
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like receptor,KLR)。
[0003]KIR(killer immunoglobulin
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like receptor,KIR)是位于NK细胞和某些T细胞表面表达的一组特异性识别人类主要组织相容性抗原MHCⅠ类分子的受体，对NK细胞效应功能的发挥起重要免疫调节作用。KIR位于人类19q13.4，白细胞受体复合物(LRC)上，跨距约150kb、头尾排列，聚集成簇和多态性丰富的多基因家族所编码，基因呈不规律排列，其结构和功能具有多样性。Uhrberg等首次采用PCR
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SSP方法对KIR进行基因分型，显示了在不同NK细胞克隆含有不同数目和种类的KIR基因。由于KIR基因分型方法的不断改进和完善，KIR基因家族成员的不断扩增，先前忽略的基因，假基因和变体不断浮出水面，Katharine等证实通过家系分离和基因组测序和基因序列的确定，单凭基因含量就超过20多种KIR单倍型和至少40
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50种KIR基因型，目前在低分辨水平上可检测的有18个KIR基因型，即KIR1D、KIR2D1
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5、KIR2DS1
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5、KIR3DL1
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3、KIR3DS1、假基因Xv、X和KIR2DP1，这些基因表现出不同程度的多态性。在Uhrberg、Norman和Gomez
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Lozano等人的工作基础上，其他研究工作者通过重新调整合成多对引物优化KIR分型的正确性。
[0004]目前主要的KIR基因分型方法有PCR
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RFLP法、PCR
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SSOP法、PCR
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SSP法、实时荧光定量PCR法及PCR
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SBT法。PCR
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RFLP即PCR
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限制性片段长度多态性检测技术，基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。此方法需构建等位基因特异性酶切位点，操作复杂，结果不能自动获得且带有主观性。PCR
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SSOP即PCR
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特异性序列寡核苷酸探针，基本方法是用人工合成的KIR型别特异的寡核
苷酸序列作为探针，与待检样品经PCR扩增的KIR基因片段杂交，从而确定KIR型别。此法存在大量探针设计困难，以及在实验程序的最佳条件摸索中需要投入巨大的人力物力，并需配备杂交仪，而且实验室间可重复性差、准确度有待提高。PCR
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SSP即序列特异性引物技术，基本方法是设计出一整套等位基因特异性引物，借助PCR技术获得KIR型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定KIR型别。此法操作相对简单，省去酶切、杂交等步骤，PCR扩增后直接电泳观察结果，如今广泛应用于临床。但其结果无法自动获得，带有主观性，准确度有待提高。实时荧光定量PCR(Real
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time PCR)技术通过实时监测杂交探针释放的荧光信号，能够定性或者定量检测样本中的核酸，操作简单，但得不到高分型别。PCR
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SBT(PCR
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直接测序法)也可用于KIR基因分型，sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准，是包括荧光定量PCR Taqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。但传统的KIR测序需要分段设计多组引物，设计复杂，未得到广泛应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供了一种快速长片段扩增酶及其在KIR基因测序中的应用，通过本专利技术提供的经修饰的DNA聚合酶可在一个PCR反应实现对KIR亚型基因的全长扩增，长至16kb。旨在克服现有技术的不足之处，实现长片段序列的快速准确扩增，每个KIR亚型只需要一对引物组即可实现全长扩增，使KIR基因测序扩增更快速简单的进行。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种快速长片段扩增酶，其为经氨基酸序列修饰的可快速扩增长片段的DNA聚合酶，所述的修饰的DNA聚合酶与未修饰的DNA聚合酶的氨基酸序列相比，进行如下突变：第145位的亮氨酸L突变为谷氨酰胺Q，第719位的缬氨酸V突变为天冬酰胺N，所述快速长片段扩增酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 48所示。
[0008]本专利技术中“未修饰的DNA聚合酶”，是指Taq DNA Polymerase，来自Thermo，货号EP0406。
[0009]本专利技术的扩增酶的氨基酸序列中L145Q和V719N，氨基酸活性基团从负电荷团改变为带正电荷的氨基酸分子，使反应模板DNA能更快速且紧密地与聚合酶结合，从而使反应速度加快。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供所述的快速长片段扩增酶在制备KIR基因测序试剂中的应用。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供一种KIR基因分型试剂盒，包含所述的快速长片段扩增酶，还包括PCR反应试剂、PCR扩增引物及测序引物。
[0012]所述的PCR反应试剂包括：0.5mM脱氧核苷酸(dNTP)，40mM氯化镁(MgCl2)，80mM氯化钾(KCl)，60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris
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HCl)，1mM四甲基氯化铵(TMAC)，甘油0.6％(v/v)，甲酚红0.02％(v/v)和甜菜碱5％(v/v)。
[0013]所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速长片段扩增酶，其特征在于，其为经氨基酸序列修饰的可快速扩增长片段的DNA聚合酶，所述的修饰的DNA聚合酶与未修饰的DNA聚合酶的氨基酸序列相比，进行如下突变：第145位的亮氨酸L突变为谷氨酰胺Q，第719位的缬氨酸V突变为天冬酰胺N，所述快速长片段扩增酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 48所示。2.如权利要求1所述的快速长片段扩增酶在制备KIR基因测序试剂中的应用。3.一种KIR基因分型试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的快速长片段扩增酶，还包括PCR反应试剂、PCR扩增引物及测序引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂包括：0.5mM脱氧核苷酸dNTP，40mM氯化镁MgCl2，80mM氯化钾KCl，60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris
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HCl，1mM四...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈炤源，王浩，章婷婷，崔江应，
申请(专利权)人：江苏伟禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：