海洋DNA聚合酶I制造技术

本发明专利技术涉及DNA聚合酶。特别地，本发明专利技术涉及海洋来源的热不稳定DNA聚合酶，其具有高聚合酶活性、链置换活性和3

Marine DNA polymerase I

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】海洋DNA聚合酶I


[0001]本专利技术涉及DNA聚合酶。特别地，本专利技术涉及海洋来源的热不稳定DNA聚合酶。此外，本专利技术提供了基本上没有链置换活性的热不稳定DNA聚合酶。本专利技术还涉及所述DNA聚合酶在各种分子生物学过程(方法，processes)中的用途。

技术介绍

[0002]合成生物学是一个快速发展的领域，并且被誉为应对未来生物经济和生物能源挑战的可能解决方案。合成生物学的最终愿景是创造新的细胞生物操作系统，其可预见地能够执行有用的任务。合成生物学流程的关键步骤之一是将DNA片段组装成更大的功能构建体，其通常涉及多重组装。
[0003]然而，当前的瓶颈是缺乏一种稳健的室温方法来进行多重DNA组装，而无需耗时的手动处理步骤。因此，非常需要一种能够绕过当前障碍的新DNA组装方法。
[0004]基因组DNA的复制是DNA聚合酶的主要功能，它催化从单脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)合成多脱氧核糖核苷酸。
[0005]在体外，DNA聚合酶的特性被用于DNA合成，例如各种DNA扩增过程、DNA组装过程以及读取目标(所关注的)DNA链模板的DNA分子合成从而产生与模板匹配的两条新DNA链。
[0006]发现了不同类型的聚合酶。例如，在大肠杆菌和其它原核细胞中，已知的DNA聚合酶通常称为DNA聚合酶I
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V。各个组在复制保真度、热稳定性、延伸率以及校对活性(proof
‑
reading activity)和效率方面有差异。一些DNA聚合酶相当简单，而另一些则更复杂，例如由20个不同肽亚基组成的大肠杆菌聚合酶III。当用于体外DNA复制过程时，除dNTP外，还需要引物(初始寡核苷酸)，其携带可用作链增长起始点的3
’
端羟基，这是因为DNA聚合酶不能启动从单核苷酸的从头合成过程。引物可以是一段短或长的DNA或RNA，其携带有游离的3'
‑
OH基团，通过退火到模板的互补区域为DNA聚合酶提供双链结构。选定的DNA聚合酶沿模板工作，沿5'
→
3'方向延伸引物。
[0007]由于DNA链的极性，DNA分子的两条链的复制是双向的，根据模板复制的方向产生两种不同的产物，“前导”链和“后随(滞后，lagging)”链。前导链被合成为单个连续链，而后随链最初被合成为小的寡核苷酸，称为冈崎片段，然后连接形成连续链。在体内，小RNA分子作为天然引物在前导链以及特别是后随链这两者的合成中发挥作用。
[0008]众所周知，DNA聚合酶III连续地合成前导链以及后随链上的冈崎片段，在合成片段之间留下间隙(空隙、缺口，gap)，该间隙随后由DNA聚合酶I填充。
[0009]除了DNA合成活性外，DNA聚合酶还可以发挥其它酶活性，例如3
’‑5’
核酸外切酶活性或链置换活性。DNA聚合酶的链置换活性的作用是在连接前去除起始RNA或引物。在体内，一些DNA聚合酶的3
’‑5’
核酸外切酶活性对于遗传稳定性、纠正DNA聚合酶错误很重要，例如在生成的DNA分子中产生错配碱基对，然后通过DNA聚合酶的核酸外切酶功能进行校正。
[0010]Piotrowski,Y.et al.,Molecular and Cell biology,2019,第1
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11页和Singh,K.et al.,J.of Biological Chemistry,2007,vol.282,no.14,第10594
‑
10604页公开了具
有改变的链置换活性的突变DNA聚合酶。
[0011]为了替换和纠正错配的碱基对，DNA聚合酶的校对活性必须能够去除错误引入的dNTP，因此核酸酶活性与DNA分子磷酸骨架中的磷酸二酯键的断裂有关。去除错配的dNTP并从而降解DNA的能力以各种方式被利用于体外分子生物学中。序列特异性DNA扩增在分子生物学中有许多应用，例如确定亲子关系、法医调查和诊断学。许多广泛使用的DNA聚合酶在高温(例如高达至少70℃)下是稳定的，因此能够将其用于DNA检测和分析方法，例如聚合酶链反应(PCR)或热循环DNA测序。适用于此类过程的DNA聚合酶通常称为热稳定DNA聚合酶。
[0012]PCR基于热循环以使模板DNA变性、引物退火以及使用热稳定DNA聚合酶延伸引物，该热稳定DNA聚合酶可承受不同的温度条件，并通过扩增使目的DNA的量指数式增加。其它扩增方法是等温的，即在恒温下进行。现今，存在多种等温DNA扩增方法，例如链置换扩增(参见例如Walker GT.Empirical aspects of strand displacement amplification.PCR Methods Appl.1993；3∶1
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6)和环介导扩增(LAMP)(参见例如Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,et al.Loop
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mediated isothermal amplification ofDNA.Nucleic Acids Res.2000；28:E63)。用于链置换扩增的DNA聚合酶是市售的，例如ThermoFisher Scientific提供的EquiPhi29TM DNA聚合酶。
[0013]DNA聚合酶也用于DNA组装过程，例如Gibson et al.在Nature Methods,2009,vol.6,pp.343
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345中描述的Gibson方法，允许核酸分子的单步等温组装。然而，该方法要求该过程在50℃下进行。
[0014]然而，当前的瓶颈是缺乏一种稳健的室温方法来进行多重DNA组装，而无需耗时的手动处理步骤。例如，当在DNA组装方法中使用PCR产物时，必须对产物进行纯化(经过清理程序)，然后才能将其用于多重DNA组装过程。如果需要多轮组装，也需要纯化步骤。因此，一种能够绕过当前障碍的新DNA组装方法是非常值得期望的。
[0015]海洋来源的各种酶是已知的。例如，WO2017/162765公开了一种从冷杆菌属(Psychrobacillus sp.)分离的海洋来源的热稳定DNA聚合酶，其在很宽的温度范围内都有活性，包括高于室温的温度。
[0016]WO2016026574公开了一种源自冷水环境的热不稳定核酸外切酶，其能够降解单链DNA，并且如果暴露于低于65℃的温度则可在15
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20分钟内失活。
[0017]本专利技术人已经通过对在斯瓦尔巴特群岛附近的海洋北极地区采集的海洋环境样品进行宏基因组分析鉴定了DNA聚合酶I。与其它已知的DNA聚合酶不同，本专利技术的分离的DNA聚合酶本质上是热不稳定的，这使得所述酶在分子生物学过程中特别有用，例如在各种DNA扩增过程和DNA组装过程中。例如，本专利技术的DNA聚合酶在高于25℃的温度下，例如在高于约30℃的温度下迅速且不可逆地失活，导本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的DNA聚合酶或其酶促活性片段，其中，所述DNA聚合酶发挥链置换活性和3
’‑5’
核酸外切酶活性，并且其中，所述DNA聚合酶在高于25℃的温度下，更优选在高于约30℃的温度下，不可逆地失活。2.一种分离的DNA聚合酶或其酶促活性片段，所述DNA聚合酶包含SEQ ID No.1的氨基酸序列，或包含在整个序列长度上与SEQ ID No.1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。3.一种分离的DNA聚合酶或其酶促活性片段，所述DNA聚合酶包含SEQ ID No.2的氨基酸序列，或包含在整个序列长度上与SEQ ID No.2具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求2或权利要求3所述的分离的DNA聚合酶或其酶促活性片段，包含在整个序列长度上与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，例如在整个序列长度上与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2具有至少80％的序列同一性，例如在整个序列长度上与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2具有至少90％的序列同一性。5.根据权利要求2至4中任一项所述的分离的DNA聚合酶或其酶促活性片段，其中，所述氨基酸序列在对应于氨基酸位置431
‑
457和位置519
‑
523的至少一个氨基酸区域中包含至少一个突变，上述编号与SEQ ID NO.2中的氨基酸编号一致，并且其中所述DNA聚合酶不具有链置换活性。6.根据权利要求5所述的分离的DNA聚合酶或其酶促活性片段，其中，位置449、450、451和521的氨基酸选自下组：SEQ ID No.1的氨基酸位置氨基酸449Ser、Ala450Ala、Asp451Phe、Ala521Arg、Ala并且前提条件是位置449(S449)、450(A450)、451(F451)和521(R521)的氨基酸不同时分别为Ser、Ala、Phe和Arg。7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的DNA聚合酶或其酶促活性片段，其中，所述DNA聚合酶选自包含氨基酸序列的DNA聚合酶I的组，其中
‑
位置450的氨基酸是Asp，
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位置449和451的氨基酸是Ala，
‑
位置449和450的氨基酸分别是Ala和Asp，
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位置450和451的氨基酸分别是Asp和Ala，
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位置449、450和451的氨基酸分别是Ala、Asp和Ala，
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SEQ ID No.8中位置521的氨基酸是Ala，并且其中编号是根据SEQ ID No.1的氨基酸的编号，并且
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其中任何所述DNA聚合酶I均不具有链置换活性。8.根据权利要求5或6所述的分离的DNA聚合酶或其酶促活性片段，其中所述DNA聚合酶包含选自SEQ ID No.3、4、5、6、7和8的氨基酸序列，或包含在整个序列长度上分别与SEQ ID No.3、4、5、6、7和8具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，前提条件是
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SEQ ID No.3中位置450的氨基酸是Asp，
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SEQ ID No.4中位置449和451的氨基酸是Ala，
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SEQ ID No.5中位置449和450的氨基酸分别是Ala和Asp，
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SEQ ID No.6中位置450和451的氨基酸分别是Asp和Ala，
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【专利技术属性】
技术研发人员：阿特勒，
申请(专利权)人：特罗姆瑟大学挪威北极圈大学，
类型：发明
国别省市：