一种具有高转录活性的T7RNA聚合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有高转录活性的T7RNA聚合酶突变体及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术对原始T7RNA聚合酶进行改造，构建得到的T7RNA聚合酶突变体相对于野生型T7RNA聚合酶，具有转录效率高、合成产量高、纯度高、特异性强、贮藏稳定性好等优点。适于将T7RNA聚合酶突变体制备成RNA转录试剂盒，用于RNA疫苗和药物、体外转录、基因编辑、病毒RNA探针检测等方面，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

A t7rna polymerase mutant with high transcriptional activity and its application

【技术实现步骤摘要】
一种具有高转录活性的T7 RNA聚合酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种具有高转录活性的T7 RNA聚合酶突变体及其应用，具体涉及一种具有高转录活性的T7RNA聚合酶突变体的制备方法及一种合成siRNA的应用，属于生物


技术介绍

[0002]近年来，新型冠状病毒在全球大范围内肆虐传播，人们对于病毒遗传信息RNA的研究和mRNA等疫苗的研发需求越来越大，RNA的生理物理和生物化学研究时需要大量特定长度和特定序列的RNA分子作为研究原料，这时需要稳定高效的系统进行体外转录获得RNA，T7体外转录系统提供一个快速的方法用于合成纯净、单链的RNA分子，用T7 RNA聚合酶大规模的合成RNA已经较为广泛的应用于作为生物学活性分子的RNA的研究，T7 RNA聚合酶是一种RNA聚合酶，专门催化5
’→3’
方向的RNA形成过程。T7 RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的DNA或DNA复制品，在体内T7RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7启动子下游的所有DNA序列。针对日趋上涨的需求量，目前市售的T7 RNA聚合酶仍存在生产成本和售价高，稳定性有限，转录活性有待提升等缺点，尚不能完全满足日益增长的研究需要。
[0003]T7 RNA聚合酶的另一个重要应用是可体外转录合成用于RNA干涉实验的siRNA。RNA干涉(RNA interference，RNAi)是研究双链RNA对基因表达阻断的作用方法，它将与目的基因对应的双链RNA导入生物体，导致相应mRNA降解。它不是传统的在DNA水平上进行基因敲除，而是通过RNA干涉，在RNA水平上去除目的RNA，因而它是一种有力的研究基因功能的工具，可以快速经济地进行大量基因功能的验证。人工化学合成siRNA的存在价格昂贵，制作周期较长且合成产物不稳定的问题，T7 RNA聚合酶用于制备siRNA则有着操作简单且成本低，合成的siRNA量大等优点，能满足RNA干涉实验的实际需要。

技术实现思路

[0004]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了一种具有高转录活性的突变体T7 RNA聚合酶，可用于体外RNA的合成，并提供了一种siRNA的合成方法，用于解决现有制备siRNA成本高、步骤繁琐和产量低的技术问题。此外，本专利技术提供的突变体T7 RNA聚合酶融合了His标签，很大程度上方便后续蛋白纯化步骤，并适用于大规模生产。
[0005]本专利技术提供了一种具有高转录活性的T7 RNA聚合酶变体，所述T7 RNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0006]本专利技术提供了编码所述的T7 RNA聚合酶突变体的核苷酸序列。
[0007]在一种实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本专利技术提供了含有所述核苷酸序列的重组质粒。
[0009]在一种实施方式中，所述重组质粒以pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体为表达载体。
[0010]本专利技术提供了表达所述的T7 RNA聚合酶变体或含有所述的核苷酸序列的重组微生物细胞。
[0011]在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母为出发菌株。
[0012]本专利技术提供了所述高转录活性的突变体T7 RNA聚合酶的制备，具体步骤如下：
[0013](1)在原始的T7 RNA聚合酶基因序列上进行改造，同时根据原核大肠杆菌进行密码子优化，得到的T7 RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:l所示，并通过NdeI和XhoI酶切位点双酶切连接至大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET
‑
30a(+)中；
[0014](2)将带有目的基因片段的质粒，转化到Rosetta(DE3)大肠杆菌菌株中，通过卡那霉素筛选阳性转化子，并于37℃，220rpm条件下扩大培养，直至OD
600
＝0.4
‑
0.6，加入0.5mM的IPTG，16℃过夜诱导蛋白表达。
[0015]本专利技术提供了一种制备RNA的方法，所述方法是利用所述T7 RNA聚合酶变体以核糖核苷三磷酸为原料、利用编码目标RNA的DNA模板，转录合成目标RNA。
[0016]在一种实施方式中，所述方法步骤为：
[0017](1)合成双链DNA模板；
[0018](2)将T7 RNA聚合酶用于RNA体外转录，在35～40℃下反应1～3h；
[0019](3)双核酸酶消化处理和纯化siRNA。
[0020]在一种实施方式中，所述目标RNA包括dsRNA、ssRNA、siRNA、miRNA、piRNA、mRNA和shRNA。
[0021]本专利技术提供了含有所述T7 RNA聚合酶变体、或所述核苷酸序列的试剂盒。
[0022]在一种实施方式中，所述试剂盒中含有缓冲试剂、核糖核苷三磷酸。
[0023]在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有核酸酶抑制蛋白。
[0024]本专利技术提供了所述T7 RNA聚合酶变体在体外转录合成RNA中的应用。
[0025]在一种实施方式中，所述RNA包括mRNA、siRNA、gRNA等各类RNA前体。
[0026]本专利技术提供了所述T7 RNA聚合酶变体在制备RNA疫苗和RNA药物中的应用。
[0027]本专利技术提供了所述T7 RNA聚合酶变体在基因编辑、利用RNA探针检测病毒中的应用。
[0028]本申请的技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0029](1)本专利技术提供的突变体T7 RNA聚合酶融合了His标签，能容易的与镍柱结合降低了纯化难度，提升产量并增加了纯化的回收效果。
[0030](2)本专利技术提供的突变体T7 RNA聚合酶选用了pET
‑
30a(+)表达载体，增加了蛋白的可溶性表达，为后续的工业生产提供便利。
[0031](3)本专利技术提供的突变体T7 RNA聚合酶在体外转录合成siRNA的应用中，相比于野生型，具有转录效率高、合成产量高、纯度高、特异性强、贮藏稳定性好等优点，可以实现准确简便、成本低并且能高效稳定纯化siRNA的目的，在使用RNAi技术的研究中具有重要的应用价值。
附图说明
[0032]图1为本专利技术实施例2中使用野生型和突变体T7 RNA聚合酶在室温放置不同时间
后RNA产量图。
[0033]图2为本专利技术实施例2中使用野生型T7 RNA聚合酶合成siRNA质谱鉴定图。
[0034]图3为本专利技术实施例2中使用突变体T7 RNA聚合酶合成siRNA质谱鉴定图。
[0035]图4为本专利技术实施例3中使用两种T7 RNA聚合酶(野生型和突变体)合成siRNA转染后抑制MyoG基因相对表达量图。
[0036]图5为本专利技术实施例3中使用两种T7 RNA聚合酶(野生型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有高转录活性的T7 RNA聚合酶变体，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.编码权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述的核苷酸序列的重组质粒。4.表达权利要求1所述的T7 RNA聚合酶变体或含有权利要求2所述的核苷酸序列的重组微生物细胞。5.一种制备RNA的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的T7 RNA聚合酶变体以核糖核苷三磷酸为原料、利用编码目标RNA的DNA模板，转录合成目...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱升龙，姜旋，陈永泉，王振，叶贤龙，潘珍珍，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：