DNA聚合酶制造技术

本发明专利技术提供一种DNA聚合酶，其包括SEQ ID NO.1的序列或与所述SEQ ID NO.1的序列具有至少70％同一性的序列，但是其中所述SEQ ID NO.1的第18位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。本发明专利技术进一步提供包含SEQ ID NO.2、11和12的氨基酸序列及其变体的DNA聚合酶。本发明专利技术还提供编码所述DNA聚合酶的核酸，生产所述DNA聚合酶的方法，以及包含所述DNA聚合酶的组合物、表达载体和宿主细胞或病毒。本发明专利技术还提供所述DNA聚合酶在核苷酸聚合、扩增和测序反应中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA聚合酶本专利技术涉及DNA聚合酶。特别地，本专利技术涉及具有增强的链置换活性(SDA)的经修饰DNA聚合酶。微生物鉴定的黄金标准仍然是致病原的培养和随后的表型分化，这个过程通常需要花费几天的时间进行并分析，这种延迟可能会对传染病的发病率和死亡率产生重大影响。另外，多种生物不能在培养基上生长，因此，将无法通过现有的培养方法进行检测。全球范围内的需求是监测和诊断诸如HIV/AIDS、肺结核、疟疾、霍乱等重大传染病。在诸如埃博拉病毒、禽流感和猪流感爆发的潜在流行情况下，挑战变得更加严峻。尽管诊断技术取得了进步，但许多疑似感染的患者仍在接受经验性的抗菌疗法，而不是由迅速鉴定出传染原所决定的适当治疗。结果是过度使用了我们库存少的有效抗菌剂，由于抗菌剂耐药性的发展，有效抗菌剂的数量持续减少。明确需要使得能够鉴定特定病原体的新型快速原位分子诊断测试。聚合酶链反应(PCR)在多个方面革新了分子遗传学和诊断领域。PCR技术中的主力军是热稳定的高保真DNA聚合酶，其与加热和冷却以获得链分离、引物退火和延伸的循环事件一起，导致目标DNA序列的扩增。PCR技术现已广泛应用于生物医学和生命科学研究以及分子诊断中。即时护理(POC)诊断被描述为能够在医院环境外的患者社区中进行疾病诊断的医疗工具或装置。理想的诊断测试应符合“ASSURED”标准：价格实惠(Affordable)、灵敏(Sensitive)、特异(Specific)、用户友好(User-friendly)、快速(Rapid)而稳健、无需设备(Equipment-free)且交付(Delivered)给需要的人。POC方法优选是简单的，并且不需要热源或稳定的电源，因为这些通常在POC中是不可用的。因此，所使用的酶和试剂应在环境温度下使用。尽管PCR技术具有高潜力，但它仍然具有严格的局限性，并且需要使用高精度电动热循环设备以进行重复的加热和冷却过程，并需要技术熟练的人员来运行所述设备。由于退火过程中的虚假引发而导致的非特异性扩增是有问题的，PCR也易于受“粗”样品中的抑制性化合物的影响。此外，PCR装置的庞大设计使得PCR成为并入POC技术平台的有缺陷的解决方案，并使得基于PCR的方法难以用作POC诊断的主要技术推动者。最近，已经显现出对基于非PCR的方法，特别是等温扩增(IA)方法的越来越多的关注。在这些方法中，核酸扩增在恒定温度下进行，并且不需要高精度的温度循环和控制，也不需要在高温下稳定的酶。据报道，等温扩增方法具有与PCR相当的分析灵敏度和特异性，并且对抑制性化合物具有更高的耐受性，同时缩短了产生结果的时间，并且更易于使用。这些功能使得等温扩增方法对于那些正在开发POC分子诊断平台并旨在满足“ASSURED”标准的人们而言非常期望。在过去的十年中，已经发布了多种不同的核酸(RNA和DNA两者)等温扩增方法(Gill,P.和A.Ghaemi(2008)审阅的《核苷，核苷酸和核酸(NucleosidesNucleotidesNucleicAcids)》27(3):224-243；Craw,P.和W.Balachandran(2012)《芯片实验室(LabChip)》12(14):2469-2486；dePaz,H.D.等人(2014)《分子诊断学专家综述(ExpertRevMolDiagn)》14(7):827-843；Yan,L.等人(2014)《分子生物系统(MolBiosyst)》10(5):970-1003和正在不断开发中的新产品(Liu,W.等人(2015)《科学报告(SciReports)》5:12723)。在多种方法中，成功取决于反应装置中使用的DNA聚合酶的固有链置换活性(SDA)。术语链置换描述了聚合酶置换在合成过程中遇到的下游DNA的能力。除(POC)诊断外，其它所关注的领域也受益于DNA聚合酶助力的等温扩增技术。在这方面，全基因组扩增(多重置换扩增)很重要，特别是例如在单细胞方法中当存在极其有限量的DNA时。同样，在下一代测序方法中，链置换聚合酶也很重要，如太平洋生物科学公司(PacificBiosciences)的单分子实时(SingleMoleculeRealTime)(SMRT)DNA测序技术和由Ma等人在2013年发表的用于下一代测序的等温扩增方法所例示。(Ma,Z.等人《美国科学院院报》110(35):14320-14323)。然而，在环境温度很好发挥作用的当前的聚合酶工具箱非常有限。通常，不同的等温方法需要在30-65℃之间的反应温度，该温度主要由反应中使用的聚合酶的工作范围决定，并且易于被盐抑制。已经表征了一种属于DNA聚合酶A家族的来自嗜冷芽胞杆菌属(Psychrobacillussp)(PB)的冷适应性聚合酶。该酶在环境温度下具有高聚合酶活性，但在高达40℃的高温下仍具有良好的稳定性。特别引人关注的是，源自海洋的酶还具有良好的耐盐性和强的链置换活性(SDA)以及25℃下的熟练持续合成能力，可与最新的商业酶相当(WO2017/162765)。在多种IA方法中，仅需要聚合酶，并且该方法的有效性在很大程度上取决于聚合酶的SDA。因此，非常需要用于增加IA中使用的PB或其它聚合酶的SDA的任何物质。本专利技术人惊奇地发现，A家族中某些聚合酶的指状结构域中的单点突变，特别是单个Asp残基的置换，导致SDA显着增强。因此，在第一方面，本专利技术提供一种DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包括SEQIDNO.1的序列或与SEQIDNO.1的序列具有至少70％，优选至少75％、78％、80％、82％、85％、88％、90％、92％或95％同一性的序列，但其中SEQIDNO.1第18位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等效天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。SEQIDNO.1是PB聚合酶I的氨基酸序列的片段，其跨越截短的(缺少5'-3'-核酸外切酶结构域)野生型PB序列的405-436位氨基酸。指状结构域中的该区域(405-436)在某些DNA聚合酶A家族(也称为polI家族)中高度保守，参见图1和图5。本专利技术的DNA聚合酶通常将被分类为DNA聚合酶I或A型。本专利技术的优选的DNA聚合酶包含SEQIDNO.6、7、8、9或10的序列，但是其中每个序列第18位处的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。在一些实施例中，本专利技术的DNA聚合酶包含与SEQIDNO：1相比具有单个或多个氨基酸改变(添加、取代、插入或缺失)的氨基酸序列。除上述Asp残基的置换之外，此类序列优选地可以包含多达8个、7个或6个，例如仅1、2、3、4或5个，优选地1、2或3个，更优选地1或2个被改变的氨基酸。可以由保守或非保守氨基酸进行取代。优选地，所述改变是保守氨基酸取代。本专利技术的优选的聚合酶是经修饰PB聚合酶，进一步优选的聚合酶是来自嗜热脂肪土芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)种属(称为Bst)、来自枯草杆菌(Bacillussubtilis)(称为Bsu)、来自史密斯芽胞杆菌(Bacillussmit本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA聚合酶，其包括SEQ ID NO.1的序列或与所述SEQ ID NO.1的序列具有至少70％同一性的序列，但是其中所述SEQ ID NO.1的第18位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171215 GB 1721053.51.一种DNA聚合酶，其包括SEQIDNO.1的序列或与所述SEQIDNO.1的序列具有至少70％同一性的序列，但是其中所述SEQIDNO.1的第18位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。


2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包括与所述SEQIDNO.1具有至少88％同一性的氨基酸序列，但是其中所述SEQIDNO.1的第18位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含SEQIDNO.6、7、8、9或10的氨基酸序列，但是其中每个序列的第18位处的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。


4.一种DNA聚合酶，其包含SEQIDNO.2的氨基酸序列或与所述SEQIDNO.2具有至少60％同一性的氨基酸序列，但是其中所述SEQIDNO.2的第422位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。


5.根据前述权利要求中任一项所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含所述SEQIDNO.2的氨基酸序列或与所述SEQIDNO.2具有至少90％同一性的氨基酸序列，但是其中所述SEQIDNO.2的第422位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。


6.根据前述权利要求中任一项所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含与SEQIDNO.4具有至少60％同一性的氨基酸序列，但是其中所述SEQIDNO.4的第719位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。


7.一种DNA聚合酶，其包含SEQIDNO.11或12的氨基酸序列或与所述SEQIDNO.11或12具有至少60％同一性的氨基酸序列，但是其中所述SEQIDNO.11或12的第422位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。


8.根据前述权利要求中任一项所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含与SEQIDNO.11或12具有至少90％同一性的氨基酸序列，但是其中所述SEQIDNO.11或12的第422位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。


9.根据前述权利要求中任一项所述的DNA聚合酶，其中所述天冬氨酸残基已经被丙氨酸残基替代。


10.根据前述权利要求中任一项所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶的链置换活性比具有完全相同序列但相对于SEQIDNO：1或2分别在第18位或第422位或在其它序列的等同位置处具有天冬氨酸的DNA聚合酶高至少30％。


11.根据前述权利要求中任一项所述的DNA聚合酶，其中在20mM至200mMNaCl或KCl或其混合物的浓度范围内，所述DNA聚合酶表现出其最大聚合酶活...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·N·拉森，Y·彼得罗夫斯基，
申请(专利权)人：特罗姆瑟大学挪威北极圈大学，
类型：发明
国别省市：挪威;NO