基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方法及常规引物对技术

本发明专利技术提供了一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，所述恒温扩增体系包括具有串联重复序列的DNA模板、DNA聚合酶和常规引物对，所述DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，所述常规引物对是指在恒温扩增时，常规引物对结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构。该恒温扩增方法，结合具有链置换活性的DNA聚合酶和常规引物(即引物结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构)即可实现指数级恒温扩增重复DNA序列。

Constant temperature amplification system, amplification method and conventional primer pair for tandem repeats based on conventional primers

【技术实现步骤摘要】
基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方法及常规引物对
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方法及常规引物对。
技术介绍
恒温扩增方法多种多样，其中主要的方法有依赖核酸序列的扩增反应(nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)、依赖解链酶的扩增反应(helicasedependentamplification，HDA)、环介导等温扩增反应(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、链置换扩增反应(stranddisplacementamplification，SDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，RPA)。这些方法的主要特征是反应体系中含有链置换活性的核酸聚合酶和特殊设计的引物，特殊设计的引物结合到模板DNA后需要折叠成特定的二级结构，便于后续的恒温扩增。但是，上述恒温扩增方法体系都需要根据扩增模板以及具体其恒温扩增原理或技术要求设计特殊引物，而不只是符合互补配对原理就可以，需要考虑很多因素，对实验人员的专业知识和操作水平有一定的要求。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方法及常规引物对。本专利技术的目的是通过以下方案实现的：本专利技术的第一方面是提供一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，所述恒温扩增体系包括具有串联重复序列的DNA模板、DNA聚合酶和常规引物对，所述DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，所述常规引物对是指在恒温扩增时，常规引物对结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构。优选地，所述具有串联重复序列的DNA模板为重复DNA序列rDs7或结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA；当重复DNA序列rDs7为模板时，所述常规引物对为：正向引物：5'GAACTTCACCAGCACACTGA3'反向引物：5'AGCCACGATCTTTGACTTGT3'当结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板时，所述常规引物对为：正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC3'反向引物：5'GCGCCGCTCCTCCTCATCG3'；或正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC3'反向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC3'。优选地，所述重复DNA序列rDs7由7个高度同源DNA序列rDs7-1～rDs7-7按照先后顺序拼接而成；rDs7-1的序列如SEQIDNO：1所示；rDs7-2的序列如SEQIDNO：2所示；rDs7-3的序列如SEQIDNO：3所示；rDs7-4的序列如SEQIDNO：4所示；rDs7-5的序列如SEQIDNO：5所示；rDs7-6的序列如SEQIDNO：6所示；rDs7-7的序列如SEQIDNO：7所示。优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0WarmStartDNA聚合酶。优选地，当进行实时恒温扩增时，需在反应体系中另加入终浓度为0.8×的SYBRGold核酸荧光染料。本专利技术的第二方面，是提供一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增方法，包括以下步骤：(1)获取含有串联重复序列的DNA模板；(2)按照Bst2.0WarmStartDNA聚合酶的说明书准备恒温扩增体系；(3)结合引物的Tm值和聚合酶的工作温度范围，设定扩增温度，然后开始恒温扩增；(4)对恒温扩增产物进行检测。优选的，所述扩增温度为59℃-65℃，恒温扩增时间为1h-3h。本专利技术的第三方面，是提供一种用于串联重复序列恒温扩增的常规引物对，所述串联重复序列的DNA模板为重复DNA序列rDs7或结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA；当重复DNA序列rDs7为模板时，所述常规引物对为：正向引物：5'GAACTTCACCAGCACACTGA3'反向引物：5'AGCCACGATCTTTGACTTGT3'当结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板时，所述常规引物对为：正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC3'反向引物：5'GCGCCGCTCCTCCTCATCG3'；或正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC3'反向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC3'。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1、相比于其它恒温扩增方法需要特殊设计的引物，即结合到模板DNA后需要折叠成特定的二级结构，才可实现恒温扩增的目的，本专利技术只需针对串联重复序列模板设计互补的两条常规引物，即正向和反向引物，便可实现恒温扩增，基于本专利技术可以尝试设计针对串联重复序列的常规引物并恒温扩增，达到检测该生物的目的。2、本专利技术的恒温扩增体系及扩增方法，结合具有链置换活性的DNA聚合酶(即Bst2.0)和常规引物(即引物结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构)即可实现指数级恒温扩增重复DNA序列。3、本专利技术的恒温扩增体系及扩增方法中，常规引物设计简单，只需针对重复序列模板序列设计完全互补配对的引物即可，而现有技术中特殊设计引物则需要具体根据其恒温扩增原理/技术要求特殊设计。4、本专利技术的恒温扩增体系及扩增方法，用常规引物即可针对串联重复序列进行恒温扩增。常规引物结合到模板后，无需折叠成特定的二级结构，丰富了针对串联重复序列的扩增方法种类。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为实施例1的凝胶电泳图；图2为实施例1中实时荧光恒温扩增的实时荧光曲线图；图3为实施例1中rDs7-1～rDs7-7的同源比对表；图4为实施例1中正向引物和反向引物与模板rDs7的结合位点示意图；图5为实施例1中模板rDs7的测序比对图；图6为实施例2的凝胶电泳图一；图7为实施例2的凝胶电泳图二；图8为实施例2中，采用II_MIRU-F/II_MIRU-R作为正反向引物恒温扩增后所得核酸的一个代表性克隆/测序图；图9为实施例2中，采用II_MIRU-F作为正反向引物恒温扩增后所得一个核酸的克隆/测序图；图10为本专利技术的扩增机制原理图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，包括具有串联重复序列的DNA模本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，其特征在于，所述恒温扩增体系包括具有串联重复序列的DNA模板、DNA聚合酶和常规引物对，所述DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，所述常规引物对是指在恒温扩增时，常规引物对结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，其特征在于，所述恒温扩增体系包括具有串联重复序列的DNA模板、DNA聚合酶和常规引物对，所述DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，所述常规引物对是指在恒温扩增时，常规引物对结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构。


2.根据权利要求1所述的基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，其特征在于，所述具有串联重复序列的DNA模板为重复DNA序列rDs7或结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA；
当重复DNA序列rDs7为模板时，所述常规引物对为：
正向引物：5'GAACTTCACCAGCACACTGA3'
反向引物：5'AGCCACGATCTTTGACTTGT3'
当结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板时，所述常规引物对为：
正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC3'
反向引物：5'GCGCCGCTCCTCCTCATCG3'；
或
正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC3'
反向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC3'。


3.根据权利要求2所述的基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，其特征在于，所述重复DNA序列rDs7由7个高度同源DNA序列rDs7-1～rDs7-7按照先后顺序拼接而成；rDs7-1的序列如SEQIDNO：1所示；rDs7-2的序列如SEQIDNO：2所示；rDs7-3的序列如SEQIDNO：3所示；rDs7-4的序列如SEQIDNO：4所示；rDs7-5的序列如SEQIDNO：5所示；rDs7-6的序列如SEQIDNO：6所示；rDs7-7的序列如SEQIDNO：7所示。


4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：范小勇，吴康，罗道良，
申请(专利权)人：上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：上海;31