用于检测核酸PAP扩增的焦磷酸化激活性荧光制造技术

本发明专利技术涉及用于测定核酸PAP扩增的焦磷酸化激活性荧光的全新荧光检测方法。荧光基团‑淬灭基团双标记阻断性引物用于PAP反应，该引物的内部区域或5'末端核苷酸带有一个荧光基团，3'末端阻断性核苷酸则带有一个淬灭基团。多个荧光基团‑淬灭基团双标记阻断性引物也用于多重PAP反应，这些引物则带有不同的荧光基团用以区分一个反应中的多个模板。

Pyrophosphorylation activated fluorescence for Pap amplification

【技术实现步骤摘要】
用于检测核酸PAP扩增的焦磷酸化激活性荧光序列表本申请同时提交序列表。
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及焦磷酸化激活性聚合反应(Pyrophosphorolysisactivatedpolymerization,PAP)核酸扩增。
技术介绍
焦磷酸化激活性聚合反应(PAP)焦磷酸化激活性聚合反应(Pyrophosphorolysisactivatedpolymerization,PAP)是一种使用3'末端阻断性引物，利用DNA聚合酶催化焦磷酸化反应串联耦合聚合反应的一种核酸扩增方法(LiuandSommer,2000；LiuandSommer,2004b)。其引物在3'末端由具有不可延伸性的核苷酸(3'末端阻断剂)如双脱氧核苷酸所封闭,因此不能直接被DNA聚合酶所延伸。当3'末端阻断性引物与其互补性DNA模板杂交时，在焦磷酸或其类似物的存在下DNA聚合酶可以去除3'末端阻断性引物上的3'末端阻断剂，这一反应称为焦磷酸化反应。然后DNA聚合酶能沿着已去除3'末端阻断剂的引物而延伸DNA模板,这一反应称为聚合反应。除了本文所引用的参考文献，PAP已经在美国专利6,534,269,7,033,763,7,105,298,7,238,480,7,504,221,7,914,995和7,919,253中所描述。在PAP中使用了3'末端阻断性引物，使得焦磷酸化反应和聚合反应的串联耦合具有极高的选择性(LiuandSommer,2004a；LiuandSommer,2004b)，因为一个显著的可导致假阳性的非特异性扩增(第二类错误)需要错配性焦磷酸化反应加上随后发生的由DNA聚合酶而产生的错误掺入性延伸反应,因此这种串联错误事件的发生概率估计为3.3×10-11。双向形式的PAP(Bi-PAP)特别适用于等位基因的特异性扩增，它使用两个相对应的3'末端阻断性引物，其3'末端的单个核苷酸相互重叠(LiuandSommer，2004a；LiuandSommer，2004b)。Bi-PAP可以在109个野生型DNA模板存在的情况下检测到一个拷贝等位基因的突变而没有假阳性扩增。DNA-PAPPAP的最初测试采用了人类多巴胺D1基因DNA模板并使用了Tfl和Taq聚合酶，证明了DNA依赖性DNA焦磷酸化反应和DNA依赖性DNA聚合反应可以串联耦合(LiuandSommer,2000)。当使用一个经过基因工程改造含有F667Y突变的DNA聚合酶TaqFS时可大大提高PAP的效率，这已被应用于其它DNA模板时所证明(LiuandSommer,2002)。RNA-PAP此后专利技术的RNA-PAP可直接扩增RNA模板而无需额外的制备。RNA-PAP开创了RNA模板扩增的新机制，其中RNA依赖性DNA焦磷酸化反应移除了杂交于RNA模板上阻断性引物的3'末端阻断剂如3'末端双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合反应则延伸被激活的引物。基于这种串联偶联，RNA-PAP对RNA模板上的不匹配的阻断性引物具有高度的选择性，导致了RNA模板的高度特异性扩增(美国专利号9,133,491)。使用无环核苷酸为阻断剂及II型聚合酶我们已证明II型DNA聚合酶可有效地催化焦磷酸化反应，激活使用2-羟基乙氧基甲基取代2'-脱氧呋喃核糖基糖的无环核苷酸为3'末端阻断剂的阻断性引物。除了I型DNA聚合酶外，II型DNA聚合酶Vent(exo-)和Pfu(exo-)也用于了以无环核苷酸为阻断性引物的PAP反应(LiuandSommer，2004c)。多重PAP因为极少甚至没有生成引物二聚体及引物错配产物(LiuandSommer，2002),PAP可在一个反应中使用多对阻断性引物(≥2)来扩增多个位点(≥2)上的多个模板(≥2)(Liuetal.，2006)。在多位点多重PAP实例中使用了八对阻断性引物来扩增人类基因组的八个位点，其中包括七个沿着人类凝血因子IX基因的30Kb序列分布在不同外显子和一个位于人类ATM基因外显子。多重PAP还可以使用多对阻断性引物来扩增一个反应中位于同一个位点的多个几乎序列相同的模板，其中序列差异可能少至只有一个碱基替换、几个碱基缺失或插入，例如KRAS基因的多个突变体序列(美国专利申请公开号20180265919)。目前用于检测核酸扩增的荧光方法目前可用的荧光化学品可以分为两种主要类型：1)DNA结合性染料(例如SYBRGreenI)，和2)荧光标记的序列特异性寡核苷酸引物或探针(例如TaqMan探针)。SYBRGreenI在溶液中呈游离状态时几乎无荧光显示，但当其与双链DNA非特异性结合时发出的荧光强度可增强1,000倍。SYBRGreenI荧光的优点包括设计简单(不需要探针)、成本低、以及具有熔融曲线用于判定特定扩增产物。然而其主要缺点是与任何双链DNA的非特异性结合如引物的二聚体也会发出非特异性荧光。另外，它也不能辨识在同一个反应中的多个模板的扩增。TaqMan探针在分子结构上是一种寡核苷酸，它带有以共价键连接到引物的5'末端核苷酸的荧光基团以及以共价键连接到3'末端核苷酸的淬灭基团。淬灭基团通过共振能量转移(FRET)的方法淬灭了荧光团发出的荧光(Hollandetal.，1991)。在PCR扩增中，当Taq聚合酶延伸引物时，其5'-3'核酸外切酶活性会水解已杂交于其模板上的探针，释放荧光基团而发出荧光。TaqMan探针的主要优点包括高特异性，高信噪比、和同时扩增多重位点，因为多个带有不同荧光基团的探针可在同一个反应中辨识多个模板的扩增。一种新的荧光检测方法及其优点我们开发了一种焦磷酸化激活的荧光方法来检测核酸PAP扩增。单重PAP使用单个荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物，该引物的荧光基团连接到内部区域或5'末端核苷酸上，淬灭基团连接到3'末端阻断性核苷酸上。多个荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物用于多重PAP，这些阻断性引物上带有不同的荧光基团以辨识同一个反应中的多个模板的扩增。
技术实现思路
I型荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物：在焦磷酸化激活性聚合反应中,用于扩增模板的一对正向和反向3'末端阻断性引物(I型)，其正向或反向阻断性引物的内部区域或5'末端核苷酸上带有荧光基团，以及在3'末端阻断性核苷酸上带有淬灭基团。一旦焦磷酸化反应去除了带有淬灭基团的3'末端阻断性核苷酸，PAP扩增中的荧光基团产生可检测到的荧光信号。一对正向和反向阻断性引物，正向或反向阻断性引物在其内部区域或5'末端核苷酸上带有FAM或HEX荧光基团和3'末端双脱氧核苷酸上带有TAMRA淬灭基团。一旦焦磷酸化反应去除了带有TAMRA淬灭基团的3'末端双脱氧核苷酸，在PAP扩增中FAM或HEX荧光基团产生可检测到的荧光信号。对于正向或反向阻断性引物，荧光基团的发射光谱与通用淬灭基团的吸收光谱是重叠的。对于正向或反向阻断性引物，荧光基团从3'末端本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于焦磷酸化激活性聚合反应中扩增模板的3'末端阻断性引物，其内部区域或5'末端核苷酸上带有荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有淬灭基团，一旦焦磷酸化反应去除了与淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的荧光基团即产生可检测到的荧光信号。/n

【技术特征摘要】
20181109 US 62/757,7671.一种用于焦磷酸化激活性聚合反应中扩增模板的3'末端阻断性引物，其内部区域或5'末端核苷酸上带有荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有淬灭基团，一旦焦磷酸化反应去除了与淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的荧光基团即产生可检测到的荧光信号。


2.根据权利要求1所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，FAM或HEX荧光基团连接在内部区域或5'末端核苷酸上，而TAMRA淬灭基团连接在3'末端双脱氧核苷酸上。


3.根据权利要求1所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，所述荧光基团的发射光谱与淬灭基团的吸收光谱重叠。


4.根据权利要求1所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其中荧光基团的位置为从3'末端起的30个碱基或更少。


5.一种用于焦磷酸化激活性聚合反应中扩增模板的3'末端阻断性引物，其内部区域或5'末端核苷酸上带有淬灭基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有荧光基团，一旦焦磷酸化反应去除了与淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的荧光基团即产生可检测到的荧光信号。


6.根据权利要求5所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，TAMRA淬灭基团连接在内部区域或5'末端核苷酸上，而FAM或HEX荧光基团连接在3'末端双脱氧核苷酸上。


7.根据权利要求5所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，所述荧光基团的发射光谱与淬灭基团的吸收光谱重叠。


8.根据权利要求5所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，所述淬灭基团的位置为从3'末端起的30个碱基或更少。


9.多个3'末端阻断性引物用于多重焦磷酸化激活性聚合反应以扩增在一个反应中的多个模板，包括：
a)用于扩增第一模板的第一阻断性引物，其内部区域或5'末端核苷酸上带有第一荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有一种通用淬灭基团，一旦焦磷酸化反应去除了与淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的第一荧光基团即产生可检测到的荧光信号；和
b)用于扩增第二模板的第二阻断性引物，其内部区域或5'末端核苷酸上带有第二荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有相同的通用淬灭基团，一旦焦磷酸化反应去除了与相同的通...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁少峰，刘强，
申请(专利权)人：丁少峰，刘强，
类型：发明
国别省市：美国;US