本发明专利技术属于DNA糖基化酶检测技术领域，具体涉及一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用。提供同时检测多种DNA糖基化酶的方法、提高检测精度有利于降低分析检测成本，提高临床应用实用性。本发明专利技术提供了一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的方法，它将单分子检测与滚环扩增驱动的编码不同的荧光分子结合起来，可用于在单细胞水平上同时检测癌细胞中的多种DNA糖基化酶，并能区分正常细胞与癌细胞。它可以进一步用于酶动力学参数的分析和DNA糖基化酶抑制剂的筛选，在生物医学研究、临床诊断和药物开发中具有巨大的潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用
本专利技术属于DNA糖基化酶检测
，具体涉及一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)数量及活性的荧光化学传感器及其检测方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。DNA损伤是生物体自发产生的危害，为了抵消DNA损伤的有害作用，细胞参与了多种修复机制，例如碱基切除修复(BER)。BER途径由DNA糖基化酶启动，DNA糖基化酶识别受损和错配的碱基，并通过水解碱基与脱氧核糖之间的N-糖苷键而将其从DNA中切除并产生脱嘌呤/脱嘧啶位点(AP位点)，以进行下游BER修复过程。人类细胞中DNA糖基化酶的异常表达可能引起碱基切除修复的功能失调，并最终导致各种疾病。因此，同时检测多种DNA糖基化酶将有利于研究DNA损伤修复过程和早期临床诊断。为了提高检测灵敏度，提出了一些核酸扩增方法。其中，滚环扩增(RCA)可以在1小时内实现约1000倍的扩增，产生具有串联重复序列的非常长的单链DNA(ssDNA)。因其反应条件简单、扩增效率高的特点，一经建立便引起了很大关注，且日渐多元化。单分子检测是定量目标分子最简单、最直接的方法，能够对单个分子进行测量。与传统的整体荧光测量相比，基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测具有显著的优势，即灵敏度高、样品消耗低、信噪比高，是定量生物传感的理想平台，已应用于单分子水平的DNA、microRNA、蛋白和癌细胞的灵敏检测。高效液相色谱法是一种高效的检测方法，但它需要繁琐的DNA裂解和昂贵的仪器。金纳米颗粒比色法可以直观检测DNA糖基化酶，但由于金纳米颗粒(AuNP)的制备和修饰过程复杂，检测灵敏度低。凝胶电泳结合放射性标记被认为是DNA糖基化酶(例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)分析的金标准方法，但该方法耗时长、灵敏度低、样品消耗量大、对操作技巧要求高，不适合定量分析并且伴随有害辐射。已有的与本专利技术最相近似的实现方案是基于滚环扩增的糖基化酶检测，它们通常涉及到荧光团-猝灭剂标记的探针，且因为所有的原材料都是在一个均匀的体系中，所以在扩增过程中没有特异性，只能检测一种DNA糖基化酶。在本专利技术研究团队之前的研究中，针对同时检测多种DNA糖基化酶的的方法进行了研究，提供了一种通过糖基化酶切割两种分子信标从而释放荧光信号的检测方法。
技术实现思路
针对上述研究背景，专利技术人研究团队针对同时检测多种糖基化酶的方法进行了深入的研究，提供了一种基于双链DNA底物及滚环扩增方法对人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)两种糖基化酶进行扩增的方法。本专利技术提供的方法中，通过巧妙地设计了两个环状模板，利用荧光染料标记的核苷酸使两个RCA过程的引物、模板和原料具有特异性，从而实现了同时检测同一系统中两种DNA糖基化酶，而且无需使用专门标记的检测探针。通过改变双功能DNA的识别位点，还可以用来检测其他酶。针对上述技术方案，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术第一方面，提供一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括双链DNA(dsDNA)底物、人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的环状模板；优选的，所述含有次黄嘌呤碱基(I)碱基单链及含有尿嘧啶(U)碱基单链的5'端均采用生物素修饰，3'端均采用NH2修饰。优选的，所述hAAG的环状模板由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)三种碱基组成。优选的，所述hAAG的引物通过APE1切割单链中的次黄嘌呤碱基而产生。优选的，所述UDG的环状模板由A，T和胞嘧啶(C)三种碱基组成。优选的，所述UDG的引物通过APE1切割单链中的尿嘧啶碱基而产生。优选的，所述引物与模板在phi29聚合酶存在下引发RCA反应。优选的，所述荧光化学传感器还包括磁珠、核酸外切酶及荧光分子标记的dCTP和dGTP，脱氧核糖核苷酸dATP及dTTP。进一步优选的，所述磁珠为链霉亲和素包被的磁珠。进一步优选的，所述荧光分子标记的dCTP和dGTP为Cy3-dCTP和Cy5-dGTP。本专利技术第二方面，提供一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的方法，所述方法包括采用双链DNA底物，核酸内切酶及环状模板进行滚换扩增。优选的，所述检测方法具体包括以下步骤：将待测物加入反应溶液A中进行孵育获得扩增产物，向孵育后的产物中加入磁珠溶液进行避光孵育，之后通过磁力将磁珠从反应液中分离得到扩增产物与磁珠的结合物，通过核酸外切酶消化所述结合物并对上清中的荧光进行检测。进一步优选的，所述反应溶液A中包含双链DNA(dsDNA)底物，环状模板，APE1酶，phi29聚合酶，Cy3-dCTP，Cy5-dGTP，dATP和dTTP。进一步优选的，所述磁珠溶液为链霉亲和素包被的磁珠溶液。本专利技术第三方面，提供第一方面所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的荧光化学传感器和/或第二方面所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的方法在筛选人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)抑制剂/激活剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.经本专利技术验证，基于RCA的高扩增效率和单分子检测的高信噪比，该荧光化学传感器用于同时检测多种DNA糖基化酶，检测非常灵敏，hAAG的检测限为6.10×10-9U每毫升，UDG的检测限为1.54×10-9U每毫升。基于分子信标切割法中hOGG1检测限为2.23×10-6U每微升，hAAG检测限为8.69×10-7U每微升，提高了5个数量级；该方法hAAG的灵敏度与基于磁珠的荧光测定法(1×10-4U/μL)和基于超支链信号放大的荧光测定法(9×10-5U/μL)相比，提高了7个数量级，与碱基切除修复介导的级联三信号放大(2.6×10-5U/μL)相比，提高了6个数量级；该方法UDG的灵敏度与发光分析法(2×10-5U/μL)相比，提高了6个数量级，与基于酶辅助双环级联信号放大的荧光方法(1×10-7U/μL)相比，该方法的灵敏度提高了4个数量级。该方法可以实现单细胞水平上同时检测癌细胞中的多种酶，具有良好的特异性，可以用于多种肿瘤细胞的检测，应用与临床诊断与药物开发具有巨大的潜力。2.相比专利技术人以往研究中提供的同时检测多种DNA糖基化酶的方法，本专利技术提供的检测方法无需特殊标记的检测探针，通过RCA驱动的不同荧光分子的编码，大大增加每个串联体的荧光分子数量，并且，本专利技术提本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器包括双链DNA底物、人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的环状模板；/n所述双链DNA底物中，其中一条链中具有具有次黄嘌呤碱基用于hAAG识别，另一条链上具有尿嘧啶碱基用于UDG识别，分别被APE1切割形成两个引物分别与对应的模板杂交进行扩增。/n
【技术特征摘要】
1.一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器包括双链DNA底物、人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的环状模板；
所述双链DNA底物中，其中一条链中具有具有次黄嘌呤碱基用于hAAG识别，另一条链上具有尿嘧啶碱基用于UDG识别，分别被APE1切割形成两个引物分别与对应的模板杂交进行扩增。
2.如权利要求1所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述含有次黄嘌呤碱基(I)碱基单链及含有尿嘧啶(U)碱基单链的5'端均采用生物素修饰，3'端均采用NH2修饰。
3.如权利要求1所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述hAAG的环状模板由A、T和G三种碱基组成，或所述hAAG的引物通过APE1切割单链中的次黄嘌呤碱基而产生。
4.如权利要求1所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述UDG的环状模板由A，T和C三种碱基组成；或所述UDG的引物通过APE1切割单链中的尿嘧啶碱基而产生。
5.如权利要求1所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器还包括磁珠、核酸外切酶及荧光分子标记的dCTP和dGTP，脱氧核糖核苷酸dATP及dTTP。
6.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，李琛琛，陈慧燕，胡娟，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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