一种基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法技术

本发明专利技术基于重组酶聚合酶扩增技术对半乳糖进行检测,可用于对食品等生物样品含有的半乳糖成分进行定性、定量的检测方法，该方法结合重组酶聚合酶对核酸模板指数放大的特点与半乳糖阻遏蛋白对扩增的抑制作用,利用半乳糖特异性调节半乳糖阻遏蛋白抑制作用的效果，开发出半乳糖对重组酶聚合酶扩增的“开关式”调控方法，通过对扩增产物检测进而特异性检测溶液中半乳糖成分并进行定量。该发明专利技术提出了一种能在生物样品中经济、快捷、方便的特异性检测半乳糖的新式方法。

A method of galactose detection based on recombinant enzyme PCR

【技术实现步骤摘要】
一种基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法
本专利技术涉及生物样品检测领域，主要涉及一种基于重组酶聚合酶扩增技术的检测半乳糖的方法，该方法可用于对食品等生物样品中的半乳糖定性、定量分析。
技术介绍
半乳糖是一种天然醛己糖，主要以D-构型存在。人体通过各种乳制品及非乳制品食物获得(如水果、蔬菜、谷物、油料类等)，其游离的或结合的半乳糖形式(例如低聚糖和多糖、糖蛋白和糖脂)，并在人体内作为碳水化合物参与正常代谢同时作为促进婴幼儿脑部神经发育的重要物质。乳糖占牛奶中的2-8％，作为婴幼儿断乳前的主要能量来源，正常情况下，摄入后，在小肠分解成单糖，分解的半乳糖经半乳糖激酶、半乳糖1-磷酸尿嘧啶转移酶、和尿苷二磷酸半乳糖-4'表异构酶的作用进入糖酵解过程，当这些酶其中一种在体内无法被有效合成时都会导致半乳糖在体内的堆积形成半乳糖血症，使患儿遭受各种健康困扰如白内障，肝脏疾病，肾脏，大脑损害等问题等。实施在饮食中限制半乳糖是有益的措施，大大降低了这类患儿严重的临床症状。但值得注意的是所有年龄段的患者终生都必须接受半乳糖限制饮食。半乳糖与葡萄糖缩合成的乳糖作为一种甜味剂已广泛添加入各种加工食物中，例如饼干，糖果，奶油，奶酪等，准确定性各种食品中的半乳糖成分，有利于规避对半乳糖血症患者的食品安全问题。以牛奶为基础的乳制品在食品市场上占据了优势地位，它除了含有半乳糖外，还具备大量的优质蛋白，矿物质元素等。为解决半乳糖血症患者食用这些产品的健康问题，乳制品公司已开发相应策略，生产不含乳糖和不含半乳糖的乳制品。但评估这些产品中剩余半乳糖的含量是必要的，不仅为半乳糖血症患者提供食品安全支持依据，并能对去除半乳糖的相关工艺进行质量测评。组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)是2006年由英国TwistDxInc公司研发的一种核酸等温扩增技术。RPA技术由重组酶与引物结合形成的复合物在模板上寻找同源序列，定位后引发链交换反应，启动DNA的合成，对模板上的目的片段进行指数扩增。RPA技术在25℃-42℃的恒温条件下即可快速完成核酸的扩增，其扩增产物可以通过探针法荧光定量进行实时监测，也可与侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法结合进行检测。该技术与其它核酸体外扩增技术相比，具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作简便等特点，且与常规PCR相比，RPA不用通过变性、退火、延伸三个不同温度环节进行复制扩增，可以在常温下进行等温扩增，无需变性，也不需要温控设备,对仪器的依赖性不，除了传统的反应管，还可以在纸片上进行试验。RPA是目前可用于即时诊断最方便快捷的核酸检测方法之一。目前应用在食品科学领域检测半乳糖有两种通用的分析方法即通过液体或气体分离的色谱法和基于半乳糖氧化酶(GalOx)或半乳糖脱氢酶(GADH)结合使用分光光度法、偏光法和荧光法检测酶产物。但是，这些方法通常操作繁琐且昂贵，耗时，并且经常需要熟练的技术人员操作它们。因此，开发一种可快速准确的检测半乳糖方法一直是亟待解决的新课题，开发一种新的便捷、快速、准确的检测半乳糖的方法，对于食品安全监测、食品化工生产等领域都有重要意义。
技术实现思路
为解决食品等生物样品中检出半乳糖存在的技术问题，本专利技术提出了一种基于RPA扩增技术检测半乳糖的全新方法，该方法利用半乳糖操纵子模型中半乳糖特异性调节GalR蛋白抑制操纵子的转录能力，结合RPA技术反应时间短(10-30min)，灵敏度高(检出低至10个拷贝的扩增模板)，反应温度低(37-42℃)并对反应模板呈指数放大优点，实现生物样本中半乳糖低成本、快速、灵敏、简便的定性及定量的检测。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法具体包含以下步骤：首先制备出用于进行RPA扩增的双链模板，其次设计出用于RPA扩增反应的引物，当添加待检单糖、GalR和RPA的扩增原料进行RPA扩增反应时，GalR结合RPA扩增模板上的识别序列阻碍了DNA聚合酶对RPA引物的有效延伸，该作用能够通过D-gal与GalR的结合，被特异性的解除，判定反应扩增产物被有效检出时，则为D-gal分子存在，并通过绘制扩增产物与不同D-gal浓度之间的拟合曲线确定两者之间的线性相关关系，同时可作为标准曲线计算出溶液中未知半乳糖的浓度。进一步地，所述的RPA扩增模板是含有GalR识别序列的DNA。进一步地，所述的RPA扩增引物，是包括上下游引物的，扩增区域包含GalR识别序列的引物。进一步地，所述的所述的GalR蛋白是基于大肠杆菌半乳糖操纵子中的GalR蛋白，该蛋白能够在操纵子中形成二聚体选择性结合特定序列并具有高亲和力，而D-gal能够结合该二聚体蛋白，通过别构作用改变蛋白结构降低蛋白与序列之间的亲和力。进一步地，所述的不同浓度半乳糖溶液为0.0625-1mM。与现有技术比，本专利技术的有益效果如下。(1)将D-gal浓度检测转化成为对RPA扩增产物信号检测，RPA对信号具有指数放大的优点，因此能够灵敏检测D-gal浓度。(2)RPA为恒温扩增反应，适用于便携式检测设备，因此便于对D-gal进行现场检测。(3)本专利技术提供基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法，与现有检测检测半乳糖的方法相比，具有检测成本低、操作简便、反应快速、敏感性和特异性高。附图说明图1是基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法的流程图。图2是基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法的原理示意图，其中1：GalR识别序列；2：GalR蛋白；3：DNA聚合酶；4：D-gal。图3是本专利技术鉴别半乳糖与其它单糖成分的实验结果图，其中左图：利用琼脂糖凝胶电泳检测的不同单糖对应的RPA扩增产物图；1：不加半乳糖作为空白对照；2-8:加入分别为各1mM的半乳糖，果糖，核糖，木糖，阿拉伯糖，葡萄糖，岩藻糖右图：绘制的不同单糖与RPA扩增产物间柱状图：其中单糖的种类为横坐标，RPA扩增产物统计灰度值为纵坐标。图4是本专利技术定量分析样品中的半乳糖浓度的实验结果图，其中左图：利用琼脂糖凝胶电泳检测的不同浓度半乳糖对应的RPA扩增产物图；1：不加半乳糖作为空白对照；2-6:加入分别为1,0.5，0.25，0.125，0.0625mMD-gal浓度对应，右图：绘制的半乳糖浓度与RPA扩增产物间的线性相关关系：其中半乳糖浓度的对数为横坐标，扣除空白对照的RPA扩增产物统计灰度值为纵坐标。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例详细说明了本专利技术，但不用于限制本专利技术的范围。本实施例采用常规实验技术，这些均是本
人员所熟悉的，可以按照本实施例使用材料厂商所提供的说明书即可进行。实施例1基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法。制备出含有GalR识别序列的质粒模板，设计RPA引物，用RPA反应扩增包含Gal本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法，其特征在于：利用GalR与核酸序列结合能力受D-gal特异性调控的作用，将GalR识别序列构建在RPA的扩增模板上，然后将该模板和GalR加入RPA扩增体系，使GalR阻断聚合酶对RPA引物的延伸反应，D-gal的特异性加入，降低了GalR结合扩增模板的能力，降低程度与D-gal浓度正相关，与产生的扩增产物呈正相关，通过绘制半乳糖浓度与RPA扩增产物散点图，拟合线性相关程度，用于计算样品中未知半乳糖浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法，其特征在于：利用GalR与核酸序列结合能力受D-gal特异性调控的作用，将GalR识别序列构建在RPA的扩增模板上，然后将该模板和GalR加入RPA扩增体系，使GalR阻断聚合酶对RPA引物的延伸反应，D-gal的特异性加入，降低了GalR结合扩增模板的能力，降低程度与D-gal浓度正相关，与产生的扩增产物呈正相关，通过绘制半乳糖浓度与RPA扩增产物散点图，拟合线性相关程度，用于计算样品中未知半乳糖浓度。


2.按照权利要求1所述基于重组酶聚合酶扩增技术检测半乳糖的方法，其特征在于：所述的RP...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵国杰，段絮英，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21