DNA纳米技术与液相色谱联用的转录因子多通路检测方法技术

技术编号:24325421 阅读:46 留言:0更新日期:2020-05-29 17:57
本发明专利技术公开了一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法,该方法为:先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子,将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合,将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放;然后核酸信号在对应扩增模板、Bst 2.0 DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增,产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA;最后采用高效液相色谱检测信号DNA,得到待测转录因子的浓度。本发明专利技术检测方法过程简单,能够一次性同时检测多种待测转录因子,实现了多目标检测,在多通路检测中获得良好的检测结果,本发明专利技术检测方法方便、可靠地对不同保留行为的DNA报告进行定量定性分析,提高了检测效率。

DNA nanotechnology combined with liquid chromatography for multi-channel detection of transcription factors

【技术实现步骤摘要】
DNA纳米技术与液相色谱联用的转录因子多通路检测方法
本专利技术涉及分析技术检测领域,更具体地,涉及一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法。
技术介绍
转录因子(Transcriptionfactors,TFs)是细胞中的一种调控蛋白,通过与基因中的DNA顺式作用元件结合,来启动和调节基因的转录过程。与此同时,也有大量研究指出,转录因子的非正常表达与活化,广泛的存在于人体的病理过程,这些病理过程包括癌症的产生与转移、病毒感染、自身免疫疾病等。因此转录因子既可以作为一种潜在的诊断标志物,又可以成为临床治疗的靶点。然而,对TFs传统的检测技术通常为免疫印迹法、DNA足迹法、核染色质免疫共沉淀等方法,这些方法存在检测过程较为繁琐、效率低下,应用面窄,无法实现多目标检测的技术问题,导致TFs作为诊断指标在临床上的应用尚不成熟。综上所述,实现快速、灵敏、低成本、多重检测转录因子是现在的研究热点之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述不足,提出一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法。本专利技术检测方法过程简单,能够一次性同时检测多种待测转录因子,实现了多目标检测,在多通路检测中获得良好的检测结果,本专利技术检测方法方便、可靠地对不同保留行为的DNA报告进行定量定性分析,有效的提高了检测效率。本专利技术的技术方案是:本专利技术提供一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法,该方法为:先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子,将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合,将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放;然后核酸信号在对应扩增模板、Bst2.0DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增,产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA;最后采用高效液相色谱检测信号DNA,得到待测转录因子的浓度。所述待测转录因子为p50、p53、AP-1、MITF、c-Myc中的任意一种或多种。该方法包括以下步骤:(1)掩蔽链信号转导:将捕获有待测转录因子的探针用柠檬酸缓冲液溶解至5μM,并加热至95℃,冷却至室温后,与磁珠进行孵育,得到捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠;用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子,并添加45nM待测转录因子对应的掩蔽链,孵育混匀,磁分离悬浮液,收集上清液;所述柠檬酸缓冲液的PH为7.4,待测转录因子对应的掩蔽链的添加量为100uL;(2)等温扩增:将上述上清液与待测转录因子对应的扩增模板、Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液混合,在60℃下反应80-100分钟,然后再加热至85℃反应5-15分钟,终止后离心,保留上清液,得到具有多种编码寡核苷酸的信号DNA;其中,Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液体积均为10uL;(3)HPLC分析:将上述得到的信号DNA进行高效液相色谱检测;高效液相色谱检测的条件为:流动相A为醋酸己铵溶液,固定相B为乙腈;梯度洗脱条件为:梯度从31%B开始,B以体积百分比匀速增加,在14分钟时到达33%B,15-20分钟为38%B,21-24分钟为41%B。步骤(1)中,优选孵育的条件为:温度为30-45℃,时间为20-40分钟;孵育混匀的条件为:温度为30-45℃,时间为20-40分钟。步骤(2)中,优选对应DNA信号的扩增模板为100nm。步骤(2)中,优选Nt.BstNBI核酸内切酶浓度为2-8u/μL,Bst2.0DNA聚合酶浓度为0.5-1.5u/μL,dNTPs混合物浓度为50-150μM。步骤(2)中,优选离心条件为以8000-15000转/分离心1-5分钟。步骤(3)中,优选高效液相色谱分析的色谱柱为C18柱,采用的色谱温度为60℃;紫外检测波长为260nm。步骤(3)中,优选醋酸己铵的浓度为100mM,pH值为7.0。本专利技术的有益效果:本专利技术的检测方法将DNA纳米技术与色谱分析技术联用,实现了TFs的多通路检测,有利于目标检测降低多成分比较的系统误差,提高临床检测效率,实现了一种检测方法同时检测多项指标,方便简捷。由生物素修饰的捕获探针(捕获有待测转录因子的探针)与掩蔽链相互作用,实现了TFs信号的转化,TFs的加入,既参与了信号的转导,又实现了检测信号增强。将核酸等温扩增技术应用其中,提高了检测的灵敏度。本专利技术与现有技术相比,本专利技术具有对转录因子免标记,高选择,高灵敏,快速、低成本,高通量、多重检测的优势,具有良好的应用前景,并且本专利技术能够实现生物样品中多种TFs的高通量检测。根据本方法得到的检测限低,检测线最低可达0.5pM,线性范围广,线性范围为10pM-8nM,且可用于癌细胞、实体瘤细胞和血液样本中TFs的多重定量检测。附图说明图1为实施例1中加入不同浓度p50检测后浓度与色谱信号的线性关系图。图2是本专利技术实施例2中本专利技术检测方法对p50检测的选择性结果图。图3是本专利技术实施例3中对比样品1-对比样品5以及五种TFs的混合样品的色谱图。图4是本专利技术实施例4中对经四种处理方式处理后的DLD-1细胞核蛋白提取物中的p-50、p53、AP-1、MITF、c-Myc的光谱结果统计结果图。具体实施方式下面实施例中所有寡核苷酸均采用高效液相色谱法纯化,所有寡核苷酸均由上海生工生物科技有限公司提供,各寡核苷酸的序列见表1。本专利技术实施例中:捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠购自于英芮诚生化科技(上海)有限公司,1×恒温扩增缓冲液购自于NewEnglandBiolabs;柠檬酸缓冲液是用分子生物学级试剂(BBI,中国上海)制备的。高效液相色谱级乙腈(ACN)从泰迪亚公司(美国俄亥俄州费尔菲尔德)获得。高效液相色谱级醋酸和己胺分别由阿拉丁(中国上海)和SigmaAldrich(美国MO)提供。纯化的重组p50(41kDa)、p53(82kDa)购自美国EnzoLifeSciences。小眼畸形相关转录因子(MITF,46.8kDa)购自OriGene科技公司,牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、凝血酶(thrombin)、γ-干扰素(IFN-γ)、AP-1、c-Myc均购自于SigmaAldrich(美国MO),Bst2.0DNA聚合酶、Nt.BstNBI、dNTPs购自于NewEnglandBiolabs。表1.本专利技术使用的寡核苷酸序列表实施例1本专利技术检测方法用于检测待测转录因子p50,检测方法包括以下步骤:(1)掩蔽链信号转导:将捕获有待测转录因子的探针(p50-捕获探针)用柠檬酸缓冲液溶解至5μM,并加热至95℃,10分钟后冷却至室温后(至少1h),与磁珠在37℃下孵育30分钟,得到p50-捕获探针修饰的磁珠;用p50-捕获探针修饰的磁本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法,其特征在于,该方法为:先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子,将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合,将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放;然后核酸信号在对应扩增模板、Bst2.0DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增,产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA;最后采用高效液相色谱检测信号DNA,得到待测转录因子的浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法,其特征在于,该方法为:先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子,将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合,将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放;然后核酸信号在对应扩增模板、Bst2.0DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增,产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA;最后采用高效液相色谱检测信号DNA,得到待测转录因子的浓度。


2.根据权利要求1所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法,其特征在于,所述待测转录因子为p50、p53、AP-1、MITF、c-Myc中的任意一种或多种。


3.根据权利要求1所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)掩蔽链信号转导:将捕获有待测转录因子的探针用柠檬酸缓冲液溶解至5μM,并加热至95℃,冷却至室温后,与磁珠进行孵育,得到捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠;用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子,并添加45nM待测转录因子对应的掩蔽链,孵育混匀,磁分离悬浮液,收集上清液;
(2)等温扩增:将上述上清液与待测转录因子对应的扩增模板、Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液混合,在60℃下反应80-100分钟,然后再加热至85℃反应5-15分钟,终止后离心,保留上清液,得到具有多种编码寡核苷酸的信号DNA;
(3)HPLC分析:将上述得到的信号DNA进行高效液相色谱检测;高效液相色谱检测的条件为:...

【专利技术属性】
技术研发人员:周学敏李昺之陈月严孝强朱婉莹王晶卢巧云洪俊丽
申请(专利权)人:南京医科大学
类型:发明
国别省市:江苏;32

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1