扩增单个细胞转录组的方法技术

本公开提供了用于使用逆转录和基于多次退火和成环的扩增循环的组合扩增RNA的方法。使用引物，从而使所得扩增子包含第一细胞特异性条码序列，第二细胞特异性条码序列和独特分子标识符条码序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】扩增单个细胞转录组的方法相关申请信息本申请要求于2017年5月29日提交的第62/512,144号美国临时申请的优先权，并通过引用将其整体纳入本文用于所有目的。政府权益声明本专利技术是在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)的CA174560和CA186693下于政府资助下完成。政府对本专利技术享有某些权利。背景专利
本专利技术的实施方式一般涉及用于单个细胞信使RNA扩增的方法和组合物，诸如来自单个细胞的信使RNA。
技术介绍
已知单个细胞RNA测序技术。参见Wen等,GenomeBiology(2016)17:17,DOI10.1186/s13059-016-0941-0；Mortazavi等,NatureMethodsDOI:10.1038/nmeth.1226；Chapman等,PLoSONE10(3):e0120889,doi:10.1371/journal.pone.0120889(2015)；和Sheng等,NatureMethodsDOI:10.1038/NMETH.4145(2017)。Tang等(2009)单个细胞的mRNA-Seq全转录组分析(mRNA-Seqwhole-transcriptomeanalysisofasinglecell).NatMethods,6,377-382对于scRNA-seq的首次报道使用多聚-T引物用于cDNA合成，然后进行多聚-A加尾，第二链合成和PCR。后续技术进展包括：添加模板转换以改善RNA回收效率(参见Islam,S.,Kjallquist,U.,Moliner,A.,Zajac,P.,Fan,J.B.,Lonnerberg,P.和Linnarsson,S.(2011)通过高度多重化RNA-seq表征单细胞转录(Characterizationofthesingle-celltranscriptionallandscapebyhighlymultiplexRNA-seq).GenomeRes,21,1160-1167；Picelli,S.,Bjorklund,A.K.,Faridani,O.R.,Sagasser,S.,Winberg,G.和Sandberg,R.(2013)用于在单个细胞中进行灵敏全长转录组概况的Smart-seq2(Smart-seq2forsensitivefull-lengthtranscriptomeprofilinginsinglecells).NatMethods,10,1096-109)，细胞特异性条码以允许样品进行多重化(参见Jaitin,D.A.,Kenigsberg,E.,Keren-Shaul,H.,Elefant,N.,Paul,F.,Zaretsky,I.,Mildner,A.,Cohen,N.,Jung,S.,Tanay,A.等.(2014)大规模平行单细胞RNA-seq用于将无标志物分解组织为细胞类型(Massivelyparallelsingle-cellRNA-seqformarker-freedecompositionoftissuesintocelltypes).Science,343,776-779；Fan,H.C.,Fu,G.K.和Fodor,S.P.(2015)表达概况单个细胞的组合标记用于基因表达细胞计数(Expressionprofiling.Combinatoriallabelingofsinglecellsforgeneexpressioncytometry).Science,347,1258367)，经优化的酶促条件(参见Sasagawa,Y.,Nikaido,I.,Hayashi,T.,Danno,H.,Uno,K.D.,Imai,T.和Ueda,H.R.(2013)Quartz-Seq：高度可再生和灵敏的单细胞RNA测序方法，揭示了非遗传性基因表达异质性(Quartz-Seq:ahighlyreproducibleandsensitivesingle-cellRNAsequencingmethod,revealsnon-geneticgene-expressionheterogeneity).GenomeBiol,14,R31)，独特分子标识符以标记独特cDNA(参见Islam,S.,Zeisel,A.,Joost,S.,LaManno,G.,Zajac,P.,Kasper,M.,Lonnerberg,P.和Linnarsson,S.(2014)使用独特分子标识符的定量单细胞RNA-seq(Quantitativesingle-cellRNA-seqwithuniquemolecularidentifiers).NatMethods,11,163-166；Shiroguchi,K.,Jia,T.Z.,Sims,P.A.和Xie,X.S.(2012)数字RNA测序通过优化的单分子条码最大程度地降低了序列依赖性偏倚和扩增噪声(DigitalRNAsequencingminimizessequence-dependentbiasandamplificationnoisewithoptimizedsingle-moleculebarcodes).ProcNatlAcadSciUSA,109,1347-1352)，体外转录cDNA以减少扩增偏倚(参见Hashimshony,T.,Senderovich,N.,Avital,G.,Klochendler,A.,deLeeuw,Y.,Anavy,L.,Gennert,D.,Li,S.,Livak,K.J.,Rozenblatt-Rosen,O.等.(2016)CEL-Seq2：灵敏的高度多重化单细胞RNA-Seq(CEL-Seq2:sensitivehighly-multiplexedsingle-cellRNA-Seq)CEL-Seq2:sensitivehighly-multiplexedsingle-cellRNA-Seq.GenomeBiol,17,77)和使用微流体装置的自动化(Zheng,G.X.,Terry,J.M.,Belgrader,P.,Ryvkin,P.,Bent,Z.W.,Wilson,R.,Ziraldo,S.B.,Wheeler,T.D.,McDermott,G.P.,Zhu,J.等.(2017)单个细胞的大规模平行数字转概况(Massivelyparalleldigitaltranscriptionalprofilingofsinglecells).NatCommun,8,14049；Macosko,E.Z.,Basu,A.,Satija,R.,Nemesh,J.,Shekhar,K.,Goldman,M.,Tirosh,I.,Bialas,A.R.,Kamitaki,N.,Martersteck,E.M.等.(2015)使用纳升液滴对单个细胞进行高度平行全基因组表达概况(HighlyParallelGenome-wideExpressionProfilingofIndividualCell本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增RNA模板链的方法，其包括：/n使用逆转录酶和逆转录引物序列将所述RNA模板链逆转录成cDNA模板链，所述逆转录引物序列具有与所述RNA模板链的5'多聚(A)序列互补的3'多聚(T)序列，其中所述逆转录引物序列还包含5'自退火序列，条码引物退火位点，具有4-12个核苷酸的第一细胞特异性条码序列和具有10-30个核苷酸的第一独特分子标识符条码序列，其中所述cDNA模板链在其5'包含逆转录引物序列且所述cDNA模板链与所述RNA链杂交，/n用酶消化过量的逆转录引物序列，/n降解所述RNA链以产生作为单链的cDNA模板链，/n使所述逆转录酶失活，/n使所述酶失活，/n(a)使用DNA聚合酶和延伸引物生成包含逆转录引物序列的所述cDNA模板链的互补链，所述延伸引物在引物的5'端包含所述自退火序列，其中所述互补链在5'端包含所述自退火序列并在3'端包含其互补序列，/n(b)使所述cDNA模板链由所述互补链变性，并通过将3'端的所述自退火序列和5'端的其互补序列退火来使所述互补链成环，从而抑制所述互补链的扩增，/n重复步骤(a)和(b)数次以由所述cDNA模板链生成数个成环互补链，/n使所述数个成环互补链变性，并使用包含所述自退火序列的扩增引物扩增经变性的互补链，以产生包含所述逆转录引物序列的双链扩增子，/n使所述双链扩增子变性，并使用下述内容重复扩增经变性的扩增子数次：(1)外部条码引物，其具有与所述条码引物退火位点互补的3'序列，其中所述外部条码序列还包含5'自退火序列，测序引发序列和具有4-12个核苷酸的第二细胞特异性条码序列，和(2)包含3'自退火序列的引物，以产生具有第一细胞特异性序列、第二细胞特异性条码序列和第一独特分子标识符条码序列的所得双链扩增子。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170529 US 62/512,1441.一种扩增RNA模板链的方法，其包括：
使用逆转录酶和逆转录引物序列将所述RNA模板链逆转录成cDNA模板链，所述逆转录引物序列具有与所述RNA模板链的5'多聚(A)序列互补的3'多聚(T)序列，其中所述逆转录引物序列还包含5'自退火序列，条码引物退火位点，具有4-12个核苷酸的第一细胞特异性条码序列和具有10-30个核苷酸的第一独特分子标识符条码序列，其中所述cDNA模板链在其5'包含逆转录引物序列且所述cDNA模板链与所述RNA链杂交，
用酶消化过量的逆转录引物序列，
降解所述RNA链以产生作为单链的cDNA模板链，
使所述逆转录酶失活，
使所述酶失活，
(a)使用DNA聚合酶和延伸引物生成包含逆转录引物序列的所述cDNA模板链的互补链，所述延伸引物在引物的5'端包含所述自退火序列，其中所述互补链在5'端包含所述自退火序列并在3'端包含其互补序列，
(b)使所述cDNA模板链由所述互补链变性，并通过将3'端的所述自退火序列和5'端的其互补序列退火来使所述互补链成环，从而抑制所述互补链的扩增，
重复步骤(a)和(b)数次以由所述cDNA模板链生成数个成环互补链，
使所述数个成环互补链变性，并使用包含所述自退火序列的扩增引物扩增经变性的互补链，以产生包含所述逆转录引物序列的双链扩增子，
使所述双链扩增子变性，并使用下述内容重复扩增经变性的扩增子数次：(1)外部条码引物，其具有与所述条码引物退火位点互补的3'序列，其中所述外部条码序列还包含5'自退火序列，测序引发序列和具有4-12个核苷酸的第二细胞特异性条码序列，和(2)包含3'自退火序列的引物，以产生具有第一细胞特异性序列、第二细胞特异性条码序列和第一独特分子标识符条码序列的所得双链扩增子。


2.如权利要求1所述的方法，其中，所述RNA是信使RNA、转移RNA、核糖体RNA、长链非编码RNA或小干扰RNA。


3.如权利要求1所述的方法，其中，所述RNA来自单个细胞。


4.如权利要求1所述的方法，其中，所述RNA来自异质细胞群内的单个细胞。


5.如权利要求1所述的方法，其中，所述RNA来自单个产前细胞。


6.如权利要求1所述的方法，其中，所述RNA来自单个癌细胞。


7.如权利要求1所述的方法，其中，所述RNA来自单个循环肿瘤细胞。


8.如权利要求1所述的方法，其中，所述逆转录酶是SuperScriptII、III或IV，M-MLV逆转录酶，Maxima逆转录酶，Protoscript逆转录酶或Thermoscript逆转录酶。


9.如权利要求1所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢晓亮，A·R·查普曼，D·F·李，
申请(专利权)人：哈佛学院董事及会员团体，
类型：发明
国别省市：美国;US