一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法技术

本发明专利技术属于病毒检测技术领域，公开了一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法。本发明专利技术采用双通路双荧光通道等温平台同时检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2和甲型H1N1流感病毒RNA的存在。本发明专利技术优点是多重性，可以在一个反应体系中检测出两种病毒，检测时间周期短，适用于临床的快速检测诊断，检测病毒特异性高，准确率高；检测灵敏度高，实验结果重复性好，精密度高；检测引物具有特异性，大大提高了检测效率，节约了扩增体系中各试剂的使用量，降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】
一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法
本专利技术属于病毒检测
，公开了一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法。
技术介绍
新型冠状病毒肺炎（CoronaVirusDisease2019，COVID-19），简称“新冠肺炎”，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”，是指2019新型冠状病毒（SARS-Cov-2）感染导致的肺炎，其被鉴定为一种含单股正链RNA(ssRNA)的beta型冠状病毒（betacoronavirus），其结构与严重急性呼吸综合征SARS极其相似，新型冠状病毒基因与SARSr-CoV和MERSr-CoV有70%和40%左右序列相似性，与蝙蝠病毒TG13的全基因组序列一致性高达96%。核酸的主要序列包括有E(envelopeproteingene)，M(membraneproteingene)，N(nucleocapsidproteingene)，S(spikeproteingene)，ORF(openreadingframe)和RdRp(RNA-dependentRNApolymerasegene)。该病毒可借助飞沫，气溶胶，粪口等方式在人群间进行传播感染。新冠病毒（SARS-CoV-2）可通过其表面S-蛋白与人的ACE2受体互作的分子机制，来感染人的呼吸道上皮细胞。目前针对冠状病毒的临床诊断方法有很多，胸部CT扫描，分子诊断技术，免疫层析法等。CT扫描技术方便但特异性不够，可辅助确诊；免疫层析法操作简单，但特异性和灵敏度很差，易造成结果假阴性和假阳性，不适用临床确诊；分子诊断技术相比较而言，灵敏度高，特异性强，适用于新型冠状病毒的临床确诊及诊断。甲型H1N1流感病毒【influenzaA(H1N1)virus】是一种亚型流感病毒，属于急性呼吸道传染病，及易在人群中传播。与以往或目前的季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人传染人，人感染甲流后的早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。2009年开始，甲型H1N1流感在全球范围内大规模流行。目前针对甲型H1N1流感病毒的临床诊断方法主要有实验室检查（包括外周血检查白细胞数量、血生化检测及核酸检测）和胸部影像学检测。本次专利技术所设计的双通路双探针实时等温检测技术，是结合了荧光定量技术qPCR(quantitativereal-timePCR,qPCR)以及环导等温核酸扩增（LAMP)的反转录PCR技术。双探针引物实时等温同步检测新型冠状病毒SARS-CoV-2和甲型H1N1流感病毒的多重实时荧光定量PCR检测方法是将标准的LAMP引物与荧光和淬灭基团双区域相结合，通过解链时产生的荧光信号来检测目的片段，每扩增1条DNA链就有1个荧光分子形成，从而实现了荧光信号与PCR产物的等比例增加，进而达到定量检测的目的。LAMP是指在恒温（60-65℃）的条件下，利用6条特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶在短时间内特异、高效、快速、精确地扩增8段病毒DNA片段的新技术。将LAMP和荧光定量qPCR技术相结合，该方法可以同时在一个LAMP反应管中检测1-4个目的片段，重复性和敏感性高，可以检测到100copies以下的人类基因组DNA。双探针双通路实时等温技术可以在同一个反应体系中检测出两种病毒，节约了扩增体系中各试剂的使用量，降低检测成本，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，可被广泛应用于基础研究、疾病研究、肿瘤的诊断等方面，成为分子生物学研究中的重要工具。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术属于病毒检测
，公开了一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法，本检测方法具有很高特异性及灵敏度。优选的，本专利技术根据新型冠状毒（SARS-CoV-2）基因组序列高度保守基因ORF1ab基因和甲型H1N1流感病毒HA基因设计2组效率高、特异性强的引物，设计2组不同的探针可以进行双色荧光标记（新型冠状病毒ORF1ab基因和甲型H1N1流感病毒HA基因)，增加检测结果的准确性和特异性。优选的，本专利技术优化了试剂组合，在保证酶活性的情况下，搭配了反应缓冲液，减少了检测人员的操作步骤，降低了检测中由于操作失误导致检测结果有误。技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是包括以下步骤：第一步，引物、人工合成RNA和阳性对照质粒的合成：针对新冠病毒的保守区ORF1ab基因和甲流H1N1病毒HA基因设计引物和探针。体外合成新型冠状病毒SARS-CoV-2和甲型H1N1流感病毒目的基因的RNA片段和DNA质粒。第二步，分别以所述待测样品提取RNA核酸、人工合成RNA、阳性对照质粒为模板，使用特异性引物和探针进行Real-timeLAMP反应，仪器通道同时选择FAM通道和HEX通道进行实验：1.Real-timeLAMP扩增反应的20μL反应体系为：SARS-CoV-2ORF1ab基因RNA和甲流H1N1病毒HA基因RNA混合液2μL(0.01pg-1μg)，SARS-CoV-2ORF1ab基因探针引物（4.4μM)1μL，甲流H1N1探针引物（4.4μM)1μL，反应液10μl，DEPC水6μL；2.Real-timeLAMP扩增参数为：65℃共120个循环；FAM和HEX通路，30秒采集一次荧光信号；3.鉴定结果判断：本专利技术的检验实验范围在20分钟至40分钟内，时间过短不足检测出结果造成假阴性，实践过长会产生假阳性，如果检测结果FAM通道和HEX通道扩增曲线有明显起峰，检测Ct值均<80，则可判断为新型冠状病毒（SARS-CoV-2）和甲型H1N1流感病毒核酸阳性，否则为阴性；如果FAM通道扩增曲线有明显起峰检测Ct值为<80，则可判断为甲型H1N1流感病毒核酸阳性，否则为阴性；如果HEX通道扩增曲线有明显起峰检测Ct值为<80，则结果判断为新型冠状病毒(SARS-CoV-2）核酸阳性，否则为阴性。第三步，反应体系灵敏性试验：对阳性SARS-CoV-2核酸进行荧光PCR检测，当浓度以10倍的稀释梯度逐渐从1/10降低至1/100000时，其RFU结果达到阈值时的循环数（Ct）均小于80。同时在阳性患者RNA浓度初始值为8.2ng/uL的基础条件下，浓度稀释比例达到100000倍，仍有循环数(Ct)低于80的结果呈现，新型冠状得病毒的最低检测值可达到1/100000，该方法具有良好的敏感性。进一步地，所述第一步中SARS-CoV-2特异性引物及探针序列如图1。进一步地，述第一步中甲型H1N1流感病毒特异性引物及探针序列如图2。所述第一步中合成重组阳性对照质粒DNA序列为，SARS-CoV-2病毒ORF1ab基因片段：ttatgaggatcaagatgcacttttcgcatatacaaaacgtaatgtcatccctacta本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法，其特征在于；本专利技术采用双通路双荧光通道等温平台同时检测新型冠状病毒SARS-CoV-2和甲型H1N1流感病毒RNA的存在，包括可特异性扩增新冠病毒SARS-CoV-2 ORF1ab基因的引物和探针序列和甲型H1N1流感病毒HA基因的引物和探针序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法，其特征在于；本发明采用双通路双荧光通道等温平台同时检测新型冠状病毒SARS-CoV-2和甲型H1N1流感病毒RNA的存在，包括可特异性扩增新冠病毒SARS-CoV-2ORF1ab基因的引物和探针序列和甲型H1N1流感病毒HA基因的引物和探针序列。


2.根据权利要求1所述的检测方法中包含新冠病毒SARS-CoV-2ORF1ab基因的引物和探针序列如下，引物序列：
S-F3:5'-CCACTAGAGGAGCTACTGTA-3',
S-B3:5'-TGACAAGCTACAACACGT-3',
S-FIP:5'-AGGTGAGGGTTTTCTACATCACTATATTGGAACAAGCAAATTCTATGG-3',
S-BIP:5'-ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGTGCGAGCAAGAACAAGTG-3',
S-LF:5'-CAGTTTTTAACATGTTGTGCCAACC-3',
S-LB:5'-GAGCCATGCCTAACATGCTTAG-3',
探针序列：
S-Q-FIP:5'-AGGTGAGGGTTTTCTACATCACTATATTGGAACAAGCAAATTCTATGG-3',
S-Fd：5'-ATAGTGATGTAGAAAACCCTCACCT-3'，
针对甲型H1N1流感病毒HA基因片段合成的引物序列：
H-F3:5'-GCTAAGAGAGCAATTGAGC-3'，
H-B3:5'-ATGTAGGATTTGCTGAGCT-3'，
H-FIP:5'-CGAGTCATGATTGGGCCATGACAGTGTCATCATTTGAAAGGTTT-3'，
H-BIP:5'-AAGGTGTAACGGCAGCATGTCCGAATTTCCTTTTTTAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹秀山，于琳，
申请(专利权)人：尹秀山，
类型：发明
国别省市：辽宁;21