一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR‑Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统及其应用，所述系统包括模板、LbaCas12a、crRNA、报告单链DNA分子、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI；所述模板与待检测序列碱基互补，并合成与所述模板互补的双链DNA，所形成的双链DNA包含两个核酸内切酶Nt.BbvCI识别位点，且经剪切和聚合置换反应得到激活链序列片段；所述crRNA包括固定序列和识别序列，所述固定序列与LbaCas12a特异性识别，所述识别序列与激活链序列片段互补。本发明专利技术可用于特定序列DNA和UDG活性检测，具有成本低、响应速度快、准确性高、重复性好、操作简便的优点，抗干扰能力强，同时具有较高的灵敏度和特异性，也将在临床诊断和生物医学研究中发挥关键作用，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统及其应用
本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统及其应用。
技术介绍
DNA是活细胞中最重要的生物分子之一，参与了多种遗传信息的调节。DNA传感器是一类检测特定序列DNA的生物传感器，被广泛应用于具有实际意义特定序列DNA的检测，在医学诊断、遗传疾病、突变检测、食品控制、法医和环境监测等方面具有重要意义。一般而言，与特定疾病相关的特定序列DNA通常具有超痕量、易降解和检测环境复杂等特征。然而，当前检测特定序列DNA的检测技术通常依赖于聚合酶链式反应(PCR)，其存在一些缺点，如耗时、操作过程复杂、检测限不足、需要专门的仪器设备等。因此，开发一种能简单、超灵敏、精确检测特定序列DNA的检测方法具有重要意义。例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合症(ADIS)的相关病毒，可导致人类免疫系统崩溃，并最终通过破坏和吞噬人类T4淋巴细胞从而导致细胞死亡。到目前为止，还没有有效的艾滋病毒治疗方法。幸运的是，已经找到了治愈ADIS的抗逆转录病毒疗法，对HIV感染的早期诊断和治疗可以有效保护宿主的免疫功能并延长生存期。因此，HIV基因的早期和精确检测对于感染个体的早期诊断和临床治疗极为重要。保持基因组完整性是所有生物完成其基因转录的前提。令人遗憾的是，基因组的稳定性和准确性会受到某些内在或外在因素的干扰，例如一些毒性化学物质，紫外线辐射和物理辐射等会导致基因组的变异并诱导各种疾病的产生。在生物体中，胞嘧啶的脱氨作用可能导致双螺旋DNA中U：G碱基对的形成，最终导致G：C碱基对突变为A：T碱基对。因此，修复此类DNA损伤对维持生物体基因组完整性具有重要意义。近年来，对DNA修复的几种特定途径进行了深入研究，如错配修复(MMR)，核苷酸切除修复(NER)和碱基切除修复(BER)。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)是碱基切除修复酶中的一种重要酶。从细菌到人类的大多数生物中都存在碱基切除修复酶，该酶可以特征性地识别尿嘧啶并催化脱氧核糖和尿嘧啶之间N-糖苷键切开，从而产生一个嘌呤/嘧啶(AP)位点来启动碱基切除修复(BER)保持基因组完整性。但是，UDG的异常活性可能会阻碍包含尿嘧啶的DNA碱基切除修复过程的正常进行，从而导致各种病变，如化疗耐药性、淋巴瘤、癌症、神经退行性疾病、布鲁姆综合征和人类免疫缺陷。考虑到其重要的生物学作用，UDG已成为诊断各种疾病的有希望的治疗靶标和潜在的生物标志物。传统的检测方法，如凝胶电泳、质谱、电化学、化学发光、比色法和放射性同位素标记已被用于UDG的活性检测。但是这些方法存在耗时、灵敏度低、操作复杂等缺点。因此，建立一个能够准确、高度灵敏、有效地检测UDG活性的检测方法对临床诊断和生物医学研究均具有重要意义。CRISPR/Cas系统是RNA指导的自适应性免疫机制，用于特异性识别和裂解外源核酸。自它被发现以来，由于其在基因编辑中的重要作用而备受期待。此外，CRISPR/Cas系统可用于分析领域。Doudna发现CRISPR/Cas12a在特异性识别靶标核酸被激活后具有不加选择的切割活性(反式切割)，这揭示了CRISPR/Cas在分析中的巨大潜力。通过将Cas12assDNase激活与重组聚合酶等温扩增相结合，他们创建了一种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因(DETECTR)的方法，该方法可实现DNA的aM级检测。随后，Zhang发现CRISPR/Cas13可以结合靶单链RNA并激活其不加选择的反式切割活性(反式切割)。他们基于Cas13的SHERLOCK(特定的高灵敏度酶报告基因解锁)平台可以检测到患者样品中的寨卡病毒(ZIKV)和登革热病毒(DENV)，其浓度低至每微升1个拷贝。所有这些发现证明，CRISPR/Cas系统在分析具有巨大的潜力。但是，将CRISPR/Cas系统与某些核酸扩增技术(例如滚环扩增(RCA)，链置换扩增(SDA)，环介导的等温扩增(LAMP)和发夹链反应(HCR))结合起来进行检测目标物质尚未研究。而且，利用CRISPR/Cas系统检测其他生物分子的方法仍需要扩展。
技术实现思路
针对上述现有检测技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统及其应用，解决现有特异DNA或UDG活性检测存在灵敏度低、效率低和操作复杂等问题。为了解决上述技术问题，本专利技术采用了如下的技术方案：一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统，包括模板、LbaCas12a、crRNA、报告单链DNA分子、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI；所述模板与待检测序列碱基互补，并合成与所述模板互补的双链DNA，所形成的双链DNA包含两个核酸内切酶Nt.BbvCI识别位点，所述双链DNA经剪切和聚合置换得到激活链序列片段；所述crRNA包括固定序列和识别序列，所述固定序列与LbaCas12a特异性识别，所述识别序列与所述激活链序列片段互补；所述crRNA引导LbaCas12a与激活链序列片段结合，激活LbaCas12a的反式切割活性，从而切割报告单链DNA分子，产生荧光。进一步，所述检测系统还包括用于DNA扩增所需要的添加剂；所述添加剂包括脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、缓冲液、稀释剂、镁离子、锰离子或辅助因子。本专利技术还提供了一种上述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统在特定序列DNA的检测、UDG活性抑制剂的筛选或UDG活性生物样品的检测方面的应用。具体包括以下步骤：(1)在DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI存在下，引发增强型链置换扩增产生激活链序列片段；(2)将步骤(1)得到的激活链序列片段与crRNA识别区域互补配对激活CRISPR/Cas12a体系反式切割活性；(3)步骤(2)中被激活的CRISPR/Cas12a体系切割加入到体系中的报告单链DNA分子，检测所述体系中的荧光强度即可。本专利技术还提供了一种上述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统在HIV-1检测的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括以下步骤：S1：针对LbaCas12a序列和激活链序列片段，设计识别区域特异性的crRNA序列，所述crRNA序列如SEQIDNO：1所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；S2：合成模板-1，所述模板-1序列如SEQIDNO：2所示，所述模板-1能与待检测的HIV-1序列互补，合成双链DNA；S3：将步骤S2合成的模板-1、不同浓度的HIV-1、dNTPs、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于37℃下进行链置换扩增反应，反应结束，然后高温使酶失活，得到扩增产物；S4：取步骤S3得到的扩增产物，加入一定浓度的报告单链DNA分子、LbaCas12a和步骤S1所述的crRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统，其特征在于，包括模板、LbaCas12a、crRNA、报告单链DNA分子、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI；所述模板与待检测序列碱基互补，并合成与所述模板互补的双链DNA，所形成的双链DNA包含两个核酸内切酶Nt.BbvCI识别位点，所述双链DNA经剪切和聚合置换得到激活链序列片段；所述crRNA包括固定序列和识别序列，所述固定序列与LbaCas12a特异性识别，所述识别序列与所述激活链序列片段互补；所述crRNA引导LbaCas12a与激活链序列片段结合，激活LbaCas12a的反式切割活性，从而切割报告单链DNA分子，产生荧光。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统，其特征在于，包括模板、LbaCas12a、crRNA、报告单链DNA分子、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI；所述模板与待检测序列碱基互补，并合成与所述模板互补的双链DNA，所形成的双链DNA包含两个核酸内切酶Nt.BbvCI识别位点，所述双链DNA经剪切和聚合置换得到激活链序列片段；所述crRNA包括固定序列和识别序列，所述固定序列与LbaCas12a特异性识别，所述识别序列与所述激活链序列片段互补；所述crRNA引导LbaCas12a与激活链序列片段结合，激活LbaCas12a的反式切割活性，从而切割报告单链DNA分子，产生荧光。


2.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统，其特征在于，还包括用于DNA扩增所需要的添加剂；所述添加剂包括脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、缓冲液、稀释剂、镁离子、锰离子或辅助因子。


3.一种如权利要求1或2所述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统在特定序列DNA的检测、UDG活性抑制剂的筛选或UDG活性生物样品的检测方面的应用。


4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI存在下，引发增强型链置换扩增产生激活链序列片段；
（2）将步骤（1）得到的激活链序列片段与crRNA识别区域互补配对激活CRISPR/Cas12a体系反式切割活性；
（3）步骤（2）中被激活的CRISPR/Cas12a体系切割加入到体系中的报告单链DNA分子，检测所述体系中的荧光强度即可。


5.一种如权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统在HIV-1检测的方法，其特征在于，该方法用于非诊断或治疗目的，包括以下步骤：
S1：针对LbaCas12a序列和激活链序列片段，设计识别区域特异性的crRNA序列，所述crRNA序列如SEQIDNO：1所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；
S2：合成模板-1，所述模板-1序列如SEQIDNO：2所示，所述模板-1能与待检测的HIV-1序列互补，合成双链DNA；
S3：将步骤S2合成的模板-1、不同浓度的HIV-1、dNTPs、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于37℃下进行链置换扩增反应，反应结束，然后高温使酶失活，得到扩增产物；
S4：取步骤S3得到的扩增产物，加入一定浓度的报告单链DNA分子、LbaCas12a和步骤S1所述的crRNA分子，以适当比例混合于缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯长军，霍丹群，陈晓龙，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50