DNA聚合酶和DNA聚合酶衍生的3制造技术

本发明专利技术涉及具有DNA聚合酶和3'

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA聚合酶和DNA聚合酶衍生的3
′‑5′
外切核酸酶


[0001]本专利技术涉及具有DNA聚合酶和3
′‑5′
外切核酸酶活性的酶。具体而言，本专利技术涉及具有海洋来源的DNA聚合酶II活性和3
′‑5′
外切核酸酶活性的热不稳定酶(heat labile enzyme)。此外，本专利技术涉及主要发挥3
′‑5′
活性，即不存在聚合酶活性的DNA聚合酶。本专利技术还涉及外切核酸酶活性，例如，在重组克隆过程中或在去除污染核酸分子的过程中降解双链DNA的3
′‑5′
链而进行单链悬突(single stranded overhang)的用途。

技术介绍

[0002]合成生物学是一个快速发展的领域，被誉为应对未来生物经济和生物能源挑战的可能解决方案。合成生物学的最终愿景是创造细胞的新生物操作系统，能够可预见地执行有用的任务。合成生物学管道中的关键步骤之一是将DNA片段组装成更大的通常会涉及多个组件的功能结构。
[0003]然而，当前的瓶颈是缺乏一种稳健的室温方法进行多DNA组装而无需耗时的手动处理步骤。因此，非常需要一种能够绕过当前障碍的新DNA组装方法。
[0004]基因组DNA的复制是DNA聚合酶的主要功能，它会催化单脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)合成多脱氧核糖核苷酸。
[0005]在体外，DNA聚合酶的特性用于DNA合成，如用于各种DNA扩增过程和DNA分子的合成，读取所关注的DNA链模板，产生与模板匹配的两条新DNA链。
[0006]不同类型的聚合酶已被发现。例如，在大肠杆菌和其他原核细胞中，已知的DNA聚合酶通常称为DNA聚合酶I
‑
V。各个组在复制保真度、热稳定性、延伸率以及校对活性(proof
‑
reading activity)和效率方面各不相同。一些DNA聚合酶相当简单，而另一些则更复杂，如由20个不同肽亚基组成的大肠杆菌聚合酶III。
[0007]许多广泛使用的DNA聚合酶在高温如最高达至少70℃下是稳定的，因此能够用于DNA检测和分析方法，如聚合酶链式反应(PCR)或热循环DNA测序。适用于此类过程的DNA聚合酶通常称为热稳定DNA聚合酶。
[0008]当用于体外DNA复制过程时，除dNTP外，还需要引物(初始寡核苷酸)，携带能够用作链生长起点的3
′
末端羟基，因为DNA聚合酶不能启动单核苷酸的从头合成。引物可以是带有游离3
′‑
OH基团的DNA或RNA的短片段或长片段，通过退火到模板的互补区域而为DNA聚合酶提供双链结构。所选定的DNA聚合酶沿模板工作，将引物沿5
′→3′
方向延伸。
[0009]由于DNA链的极性，DNA分子的两条链的复制是双向的，根据模板复制的方向，会产生两种不同的产物，一条“前导(leading)”链和一条“后随(lagging)”链。前导链合成为单条连续链，而所述后随链最初合成为小寡核苷酸，称为冈崎(Okazaki)片段，然后连接形成连续链。在体内，小RNA分子作为天然引物在前导链的合成中和特别是在后随链的合成中发挥作用。
[0010]众所周知，DNA聚合酶III连续合成前导链以及后随链上的冈崎片段，在合成片段之间留下间隙，然后由DNA聚合酶I填充。
[0011]除了DNA合成活性外，DNA聚合酶还可能发挥其他酶活性，如3
′‑5′
外切核酸酶活性或链置换活性。在体内，一些DNA聚合酶的3
′‑5′
外切核酸酶活性对于遗传稳定性，纠正DNA聚合酶错误，例如，导致生成的DNA分子中碱基对错配然后通过DNA聚合酶的外切核酸酶功能进行校正的错误，是很重要的。已知DNA聚合酶II具有有效的3
′‑
5外切核酸酶活性，例如，纠正由DNA聚合酶III产生的错配错误，并且还被认为参与DNA合成后损伤如，例如，由于UV照射的损伤的修复。
[0012]为了替换和纠正错配的碱基对，DNA聚合酶的校对活性必须能够去除错误引入的dNTP，因此所述核酸酶活性涉及DNA分子磷酸骨架中的磷酸二酯键断裂。去除错配的dNTP从而降解DNA的能力在体外分子生物学中以各种方式被利用。
[0013]海洋来源的各种酶是已知的。例如，WO2017/162765公开了一种从冷杆菌属(Psychrobacillus sp.)中分离出的海洋来源的热稳定DNA聚合酶，在很宽的温度范围内，包括高于室温的温度，都有活性。
[0014]WO2016026574公开了一种源自冷水环境的热不稳定外切核酸酶，能够降解单链DNA，并且如果暴露于低于65℃的温度时在15
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20分钟内就可以失活。
[0015]本专利技术人已鉴定出一种源自粘放线菌(Moritella viscosa)的热不稳定DNA聚合酶II，令人惊讶地发现其在不存在dNTP的情况下具有非常强的3
′‑5′
外切核酸酶活性。本专利技术的酶是在来自受冬季溃疡病影响的养殖大西洋鲑鱼的粘放线菌菌株中鉴定出，这正如下文实验部分中进一步公开。
[0016]具体而言，据发现，本专利技术外切核酸酶能够结合双链DNA分子并在3
′‑5′
方向降解其末端，导致受到本专利技术的DNA聚合酶衍生的3
′‑
5外切核酸酶的DNA分子的两端都产生5
′
悬突。
[0017]此外，还发现本专利技术的所鉴定的酶在室温下具有非常差的聚合酶活性。
[0018]所述已鉴定的DNA聚合酶衍生的3
′‑5′
外切核酸酶的另一个优点是最佳活性的温度为约室温。此外，本专利技术的酶已经证实在高于25℃，如高于约30℃的温度下容易失活，导致所述外切核酸酶活性如果在约25℃的温度下使用时会在一段时间后停止。因此，例如，在用于制备5
′
悬突时，例如，在约5
‑
30分钟内，可以形成合适长度的悬突。
[0019]3′‑
5外切核酸酶活性、聚合酶活性差和热不稳定性的组合会使该酶可用于分子克隆、多核苷酸去除和DNA组装过程，如下所示。
[0020]然而，本专利技术的DNA聚合酶衍生的3
′‑5′
外切核酸酶的一个优点是所述外切核酸酶活性在dNTP存在下也是有活性的。因此，本专利技术的酶可用于，例如，制备5
′
悬突，而无需旨在去除dNTP的预纯化过程。
[0021]为了能够仅利用外切核酸酶活性，本专利技术人还合成了其中所述聚合酶活性被充分削弱或缺失的本专利技术的DNA聚合酶修饰变体。

技术实现思路

[0022]根据第一方面，提供了分离的DNA聚合酶衍生的3
′‑5′
外切核酸酶或其酶活性片段，其中所述DNA外切核酸酶基本上没有聚合酶活性并且其中所述酶在高于25℃的温度下，如在高于约30℃的温度下不可逆地失活。
[0023]根据第二方面，提供了分离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中DNA外切核酸酶基本上没有聚合酶活性，并且其中在高于25℃，如高于约30℃的温度下所述酶不可逆地失活。2.一种分离的DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶或其酶活性片段，所述DNA聚合酶包含SEQ ID No.1的氨基酸序列，或包含与SEQ ID No.1全长序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。3.一种分离的DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶或其酶活性片段，所述DNA聚合酶包含SEQ ID No.2的氨基酸序列，或包含与SEQ ID No.2全长序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求2或3所述的分离的DNA聚合酶衍生的3'
‑
5'外切核酸酶或其酶活性片段，包含与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的全长序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，如与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2全长序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，如与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2全长序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求2
‑
4中任一项所述的分离的DNA聚合酶或其酶活性片段，其中所述氨基酸序列在对应于氨基酸位置V440
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Y447和位置G519
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A523的至少一个氨基酸区域中包含至少一个突变，编号是根据SEQ ID No.2中的氨基酸编号。6.根据权利要求2
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5中任一项所述的分离的DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中442、445和568位置的氨基酸选自由以下组成的组中：SEQ ID No.1的氨基酸位置氨基酸442Asp、Glu、Ala、Gly、Val、Leu、Ile445Ser、Arg、Lys、His568Asp、Glu、Ala、Gly、Val、Leu、Ile并且条件是位置442(D442)、445(S445)和568(D568)的氨基酸分别不同时是Asp、Ser和Asp。7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中所述DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶选自包含以下氨基酸序列的DNA聚合酶衍生的3'
‑
5'外切核酸酶的组中，其中
‑
位置442的氨基酸是Ala；
‑
位置568的氨基酸是Ala；
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位置442的氨基酸是Glu；
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位置568的氨基酸是Glu；
‑
位置442和568的氨基酸是Ala；和
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位置445的氨基酸是Arg并且其中所述氨基酸的编号是根据SEQ ID No.1。8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中所述DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶包含选自由SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8组成的组中的氨基酸序列，或包含分别地与SEQ ID No.3、4、5、6、7和8全长序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，条件是
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SEQ ID No.3中位置442的氨基酸是Ala；
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SEQ ID No.4中位置568的氨基酸是Ala；
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SEQ ID No.5中位置442的氨基酸是Glu；
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SEQ ID No.6中位置568的氨基酸是Glu；
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SEQ ID No.7中位置442和568的氨基酸是Ala；和
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SEQ ID No.8中位置445的氨基酸是Arg。9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶或其酶活性片段，其中所述DNA聚合酶衍生的3'
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5'外切核酸酶是DNA聚合酶II衍生的3'
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5'外切核酸酶。10.一种组合物，包含根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿特勒，
申请(专利权)人：特罗姆瑟大学挪威北极圈大学，
类型：发明
国别省市：