用于多核苷酸无模板酶学合成的嵌合末端脱氧核苷酸转移酶制造技术

本发明专利技术涉及使用末端脱氧核苷酸转移酶无模板酶学合成多核苷酸的组合物和方法，所述末端脱氧核苷酸转移酶是源自不同物种的变体的嵌合体。嵌合体。

Chimeric terminal deoxynucleotidyl transferase for template free enzymatic synthesis of polynucleotides

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多核苷酸无模板酶学合成的嵌合末端脱氧核苷酸转移酶

技术介绍

[0001]使用大长度范围的预定序列的高度纯化的廉价多核苷酸已经成为包括基因组和诊断测序、多重核酸扩增、治疗性抗体开发、合成生物学、基于核酸的治疗剂、DNA折纸、基于DNA的数据存储等的技术的核心。最近，通过使用无模板聚合酶的基于酶的方法，例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，补充或替代基于化学的合成方法引发了人们的兴趣，因为这种酶的效率已被证实并且具有温和的无毒反应条件的益处，例如Ybert等人的国际专利公开WO2015/159023；Hiatt等人的美国专利5763594；Jensen等人，Biochemistry,57:1821
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1832(2018)。大多数基于酶的合成方法需要使用可逆封闭的三磷酸核苷，以便在多核苷酸产物中获得所需的序列。但是，与未修饰的三磷酸核苷相比，天然TdT并入这种修饰的三磷酸核苷的效率降低。因此，大量的工作已经致力于开发对于修饰的三磷酸核苷具有更好的并入效率以及其它性能特征的新的TdT变体，例如，在生长链的不同3
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序列之间降低的并入变异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.嵌合末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，其包含与下式定义的氨基酸列具有至少80％同一性的氨基酸序列：B1‑
B2‑
B3其中：B1是第一物种TdT的不具有BRCT样区域的氨基酸区段，B1从第一物种TdT的N末端延伸至第一物种TdT的VSC基序、含VSC基序与KMT基序、含KMT基序之间的氨基酸位置，其中B1在其FMR基序中包含蛋氨酸或功能等同残基的取代，当B1包括GGFRR基序时，B1在其GGFRR基序中包含第二精氨酸或功能等同残基的取代，以及当B1包括VSC基序时，B1在其VSC基序中包含缬氨酸或丝氨酸或半胱氨酸或功能等同残基的一个或多个取代；B2是第二物种TdT的氨基酸区段，B2从B1的C末端延伸至第二物种TdT的C末端，或者当B3包含一个或多个氨基酸时延伸至B3的N末端，其中当B2包括VSC基序时，B2在其VSC基序中分别包含缬氨酸或丝氨酸或半胱氨酸或功能等同残基的一个或多个取代，当B2包括GGFRR基序时，B2在其GGFRR基序中包含第二精氨酸或功能等同残基的取代，当B2包括TGSR基序时，B2在其TGSR基序中包含精氨酸或功能等同残基的取代，以及当B2包括FER基序时，B2在其FER基序中包含谷氨酸或功能等同残基的取代；以及B3是第三物种TdT的氨基酸区段，B3包含0至70个氨基酸并且从第三物种TdT的C末端延伸至B2的C末端氨基酸，其中当B3包括TGSR基序时，B3在其TGSR基序中包含精氨酸或功能等同残基的取代，并且当B3包括FER基序时，B3在其FER基序中包含谷氨酸或功能等同残基的取代；并且其中所述嵌合TdT变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，并且(ii)能够将3
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封闭的三磷酸核苷并入到核酸片段上；并且其中B1、B2和B3被选择为使得所述嵌合TdT变体具有350至410个氨基酸。2.如权利要求1所述的嵌合TdT变体，其中：(i)B1的所述FMR基序中的蛋氨酸或功能等同残基的所述取代是R或Q；当B1包括GGFRR基序时，B1的所述GGFRR基序中的所述第二精氨酸或功能等同残基的所述取代是L或N；并且当B1包括VSC基序时，B1的所述VSC基序中的半胱氨酸或功能等同残基的所述取代是G或R；(ii)当B2包括VSC基序时，B2的所述VSC基序中的半胱氨酸或功能等同残基的所述取代为R或Q；当B2包括GGFRR基序时，B2的所述GGFRR基序中所述第二精氨酸或功能等同残基的所述取代为L或N；当B2包括TGSR基序时，B2的所述TGSR基序中的精氨酸或功能等同残基的所述取代为P、N或A；并且当B2包括FER基序时，B2的所述FER基序中的谷氨酸或功能等同残基的所述取代为N、L、T或S；和(iii)当B3包括TGSR基序时，B3的所述TGSR基序中的精氨酸或功能等同残基的所述取代为P、N或A；并且当B3包括FER基序时，B3的所述FER基序中的谷氨酸或功能等同残基的所述取代是N、L、T或S。3.如权利要求1或2所述的嵌合TdT变体，其中所述第一物种TdT和所述第三物种TdT是相同的。4.如权利要求1至3中任一项所述的嵌合TdT变体，其中所述氨基酸区段B1、B2和B3中的每一个具有与选自SEQ ID NOs 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40和41的序列的氨基酸区段具有至少90％同一性的氨基酸
序列，并且其中：所述FMR基序中所述蛋氨酸或其功能等同残基的所述取代位于相对于SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、11、12和13的第63位；相对于SEQ ID NO:5的第62位；相对于SEQ ID NO:9的第64位；相对于SEQ ID NO：10、26、28、29、30、32、33、34、36、37、38和39的第61位；相对于SEQ ID NO:14的第66位；相对于SEQ ID NO:15的第47位；以及相对于SEQ ID NO：27、31、35和40的第48位；所述VSC基序中的所述缬氨酸或其功能等同残基的所述取代位于相对于SEQ ID NOs：2、3、4、6、7、8、11和12的第171位；相对于SEQ ID NO：5、32、33、34、36、37、38、39和41的第170位；相对于SEQ ID NO:9的第172位；相对于SEQ ID NO：10、28、29、30、32、33、34、36、37、38、38和41的第169位；相对于SEQ ID NO:13的第180位；相对于SEQ ID NO:14的第174位；相对于SEQ ID NO:15的第154位；相对于SEQ ID NO:26的第168位；相对于SEQ ID NO:27、35和40的第156位；以及相对于SEQ ID NO:31的第157位；所述VSC基序中所述丝氨酸或其功能等同残基的所述取代位于相对于SEQ ID NOs:2、3、4、6、7、8、11和12位的第172位；相对于SEQ ID NO:5的第171位；相对于SEQ ID NO:9的第173位；相对于SEQ ID NO：10、28、29、30的第170位；相对于SEQ ID NO:13的第181位；相对于SEQ ID NO:14的第175位；相对于SEQ ID NO:15的第155位；相对于SEQ ID NO:26的第169位；以及相对于SEQ ID NO:27、31、35和40的第157位；所述VSC基序中所述半胱氨酸或其功能等同残基的所述取代位于相对于SEQ ID NO:2、3、4、6、7、8、11和12的第173位；相对于SEQ ID NO:5的第172位；相对于SEQ ID NO:9的第174位；相对于SEQ ID NO：10、28、29、30、32、33、34、37、38、39和41的第171位；相对于SEQ ID NO:13的第182位；相对于SEQ ID NO:14的第176位；相对于SEQ ID NO:26的第170位；相对于SEQ ID NO:27、31、35、36和40的第158位；以及相对于SEQ ID NO:15的第156位；所述GGFRR基序中所述第二精氨酸或其功能等同残基的所述取代位于相对于SEQ ID NOs:2、3、4、6、7、8、11和12位的第207位；相对于SEQ ID NO:5的第206位；相对于SEQ ID NO:9的第208位；相对于SEQ ID NO：10、28、29、30、32、33、34、36、37、38、39和41的第205位；相对于SEQ ID NO:26的第204位；相对于SEQ ID NO：27、31、35和40的第192位；相对于SEQ ID NO:13的第216位；相对于SEQ ID NO:14的210位；以及相对于SEQ ID NO:15的第190位；所述TGSR基序中所述精氨酸或功能等同残基的所述取代位于相对于SEQ ID NO：2、7、8、12和33的第325位；相对于SEQ ID NO：3、4、29和32的第324位；相对于SEQ ID NO:5的第320位；相对于SEQ ID NO:6的第331位；相对于SEQ ID NO:9和26的第326位；相对于SEQ ID NO:28、30的第327位；相对于SEQ ID NO:10的第323位；相对于SEQ ID NO:11和14的第328位；相对于SEQ ID NO:13的第338位；相对于SEQ ID NO:27、31的第314位；相对于SEQ ID NO:35的第310位；相对于SEQ ID NO:31的第311位；相对于SEQ ID NO:32的第321位；相对于SEQ ID NO:33、34的第322位；相对于SEQ ID NO：36、37、38、39和41的第323位；相对于SEQ ID NO:40的第309位；以及相对于SEQ ID NO:15的第308位；和所述FER基序中所述谷氨酸或功能等同残基的所述取代位于相对于SEQ ID NO：2、7、8和12位的第328位；相对于SEQ ID NO：3、4和29的第327位；相对于SEQ ID NO:5的第323位；相对于SEQ ID NO:6的第334位；相对于SEQ ID NO:9和26的第329位；相对于SEQ ID NO：10、36、37、38、39和41的第326位；相对于SEQ ID NO:11和14的第331位；相对于SEQ ID NO:13的
第341位；相对于SEQ ID NO:27的第317位；相对于SEQ ID NO:28和30的第330位；相对于SEQ ID NO:40的第312位；相对于SEQ ID NO:35的第313位；相对于SEQ ID NO:31的第...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊莉斯，
申请(专利权)人：DNA斯克瑞普特公司，
类型：发明
国别省市：