【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、对多核苷酸合成的酶促方法的兴趣增加，这不仅是因为在许多领域，如合成生物学、crispr-cas9应用和高通量测序，对合成多核苷酸的需求增加，还因为多核苷酸合成的化学方法的局限性，如产物长度的上限、湿度敏感单体的使用和环境不友好溶剂的使用，jensen et al,biochemistry,57:1821-1832(2018)。
2、目前，用于dna和rna合成的大多数酶促方法采用无模板聚合酶，其用于实现重复循环的将3’-o-保护的核苷三磷酸延伸到引发剂或延伸链并去保护，直到获得期望序列的多核苷酸，例如hiatt和rose，国际专利公开wo96/07669。champion et al已经设计制造了tdt变体，该变体有效地整合到由steven benner开发的生长多核苷酸链可逆保护的3’-o-氨基核苷三磷酸单体中(champion et al，美国专利10752887和国际专利公开wo2020/099451；benner et al，美国专利7544794、8034923、8212020、10472383，以及hutter etal,nucleosides nucleotides nucleic acids,29(11):879-895(2010))。不幸的是，这种保护化学受到数种副反应的影响，这些副反应具有将氨基保护基团转化为加帽基团或过早地将其去除的效果，从而由于存在加帽物质而损失效率，或者由于连续添加过早去保护的单体而产生不正确的序列。benner通过对单体合成的修改解决了后一个问题(美国专利1
3、鉴于对扩展多核苷酸的无模板酶促合成应用的兴趣，如果有方法可以在酶促多核苷酸合成的背景下避免3’-氨基保护基的伪加帽问题，该领域将得到推进。
技术实现思路
1、本专利技术涉及使用3’-o-氨基保护的核苷三磷酸单体进行多核苷酸的无模板酶促合成的改进方法和试剂盒。不期望受到特定操作理论的限制，本专利技术人相信，将含有单体的反应混合物或试剂暴露于不定醛或环境醛允许这些醛将3’-o-氨基保护基转化为3’-肟，其具有对受影响链进行加帽的效应，从而降低产率。本专利技术人已经发现，通过在反应混合物和合成中采用的其它试剂中掺入至少一种醛清除剂可以获得产物产率的显著增加。
2、在一些实施方案中，本专利技术涉及合成多核苷酸的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)提供引发剂，每种引发剂具有游离的3’-羟基；(b)在反应混合物中重复以下循环直到形成多核苷酸：(i)在延伸条件下使引发剂或具有游离的3’-o-羟基的延伸片段与3’-o-氨基核苷三磷酸和不依赖模板的聚合酶接触，使得所述引发剂或延伸片段通过掺入3’-o-氨基核苷三磷酸而延伸，以形成3’-o-氨基延伸片段，以及(ii)对延伸片段去保护，以形成具有游离的3’-羟基的延伸片段，其中在所述反应混合物中存在有效量的至少一种醛清除剂。
3、在一项或多项实施方案中，所述有效量的至少一种醛清除剂通过至少一种合成试剂递送至所述反应混合物。
4、在一项或多项实施方案中，有效量的醛清除剂通过合成试剂递送至反应混合物，其包括3’-o-氨基核苷三磷酸或不依赖模板的聚合酶，或者二者的混合物。
5、在一些实施方案中，所述多核苷酸可具有预定的序列。
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1.合成多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其中通过至少一种合成试剂将所述有效量的至少一种醛清除剂递送至所述反应混合物。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述有效量的所述醛清除剂通过所述合成试剂递送至包含3’-O-氨基核苷三磷酸或不依赖模板的聚合酶或二者的混合物的反应混合物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是DNA，并且其中所述不依赖模板的聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述醛清除剂是O-取代的单羟胺或多羟胺。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述O-取代的单羟胺或多羟胺选自由以下分子式定义的化合物：
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述有效量由在所述反应混合物中浓度为1至100mM的所述醛清除剂提供。
8.用于使用无模板的聚合酶合成多核苷酸的试剂盒，其包括一个或多个小瓶的合成试剂，每个小瓶包含有效量的至少一种醛清除剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.合成多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其中通过至少一种合成试剂将所述有效量的至少一种醛清除剂递送至所述反应混合物。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述有效量的所述醛清除剂通过所述合成试剂递送至包含3’-o-氨基核苷三磷酸或不依赖模板的聚合酶或二者的混合物的反应混合物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是dna，并且其中所述不依赖模板的聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)。
5.如权利要求1-...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿德里安·霍根，
申请(专利权)人：DNA斯克瑞普特公司，
类型：发明
国别省市：
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