【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】末端脱氧核苷酸转移酶变体及其用途
背景
[0001]合成预定序列的多核苷酸是许多技术的核心，所述技术包括分子诊断学、基因组和诊断测序、核酸扩增、治疗性抗体开发、合成生物学、基于核酸的治疗、DNA折纸术、基于DNA的数据存储等。最近，由于无模板聚合酶(例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT))已证实的效率和温和的无毒反应条件的益处，通过使用此类酶的基于酶促的方法，产生了对补充或替代基于化学的合成方法的兴趣，例如Ybert等人的国际专利公开WO2015/159023；Hiatt等人的美国专利5763594；Jensen等人，Biochemistry,57:1821
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1832(2018)等等。大多数基于酶的合成方法需要使用可逆封闭的三磷酸核苷，以便在多核苷酸产物中获得所期望的序列。然而，不幸的是，与未修饰的三磷酸核苷相比，天然TdT以极大降低的效率掺入这此类修饰的三磷酸核苷。
[0002]鉴于上述情况，如果可以获得可以以更高的效率掺入可逆性封闭的三磷酸核苷的新的无模板聚合酶(如变体TDT)，则将促进无模板的基于酶促的多核苷酸合成的领域。专利技术概述
[0003]本专利技术涉及来自多种物种的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，其在将可逆性封闭的三磷酸核苷掺入多核苷酸中展示出增强的效率，并且涉及它们在合成任何预定序列的多核苷酸中的用途。
[0004]在一些实施方案中，本专利技术涉及末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，其包含与选自SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、3...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，其包含与选自SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44或47的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，其中：对于SEQ ID NO:2，第61位的亮氨酸被取代，第170位的半胱氨酸被取代，第204位的精氨酸被取代，第326位的精氨酸被取代，和第329位的甘氨酸被取代；对于SEQ ID NO:5，第48位的亮氨酸被取代，第158位的半胱氨酸被取代，第192位的精氨酸被取代，第314位的精氨酸被取代，和第317位的甘氨酸被取代；对于SEQ ID NO:8，第61位的亮氨酸被取代，第171位的酪氨酸被取代，第205位的精氨酸被取代，第327位的精氨酸被取代，和第329位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:11，第61位的亮氨酸被取代，第171位的酪氨酸被取代，第205位的精氨酸被取代，第324位的精氨酸被取代，和第327位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:14，第61位的甘氨酸被取代，第205位的精氨酸被取代，第327位的精氨酸被取代，和第330位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:17，第61位的精氨酸可以被取代或可以不被取代，第158位的丙氨酸被取代，第192位的精氨酸被取代，第311位的精氨酸被取代，和第314位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:20，第61位的精氨酸可以被取代或可以不被取代，第171位的脯氨酸可以被取代或可以不被取代，第205位的精氨酸被取代，第321位的苏氨酸被取代，和第324位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:23，第61位的精氨酸可以被取代或可以不被取代，第171位的丙氨酸可以被取代或可以不被取代，第205位的精氨酸被取代，第322位的丙氨酸可以被取代或可以不被取代，和第325位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:26，第61位的精氨酸可以被取代或可以不被取代，第171位的丙氨酸可以被取代或可以不被取代，第205位的精氨酸被取代，第322位的精氨酸被取代，和第325位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:29，第48位的甲硫氨酸被取代，第158位的半胱氨酸被取代，第192位的精氨酸被取代，第310位的精氨酸被取代，和第313位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:32，第61位的甲硫氨酸被取代，第171位的半胱氨酸被取代，第205位的精氨酸被取代，第323位的精氨酸被取代，和第326位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:35，第61位的甲硫氨酸被取代，第171位的半胱氨酸被取代，第205位的精氨酸被取代，第323位的精氨酸被取代，和第326位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:38，第61位的甲硫氨酸被取代，第171位的半胱氨酸被取代，第205位的精氨酸被取代，第323位的精氨酸被取代，和第326位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:41，第61位的甲硫氨酸被取代，第171位的半胱氨酸被取代，第205位的精氨酸被取代，第323位的精氨酸被取代，和第326位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:44，第48位的甲硫氨酸被取代，第158位的半胱氨酸被取代，第192位的精氨酸被取代，第309位的精氨酸被取代，和第312位的谷氨酸被取代；以及对于SEQ ID NO:47，第61位的甲硫氨酸被取代，第171位的半胱氨酸被取代，第205位的精氨酸被取代，第323位的精氨酸被取代，和第326位的谷氨酸被取代；以及其中所述TdT变体(i)无需模板就能够合成核酸片段，和(ii)能够将3
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修饰的核苷酸掺入到核酸片段的游离3
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羟基上。
2.如权利要求1所述的TdT变体，其中：对在以下位置处的亮氨酸的所述取代选自R或Q：SEQ ID NO:2、8或11中的第61位，或者SEQ ID NO:5中的第48位；对在以下位置处的半胱氨酸的所述取代选自G、R、P、A、V、S、N、Q或D：SEQ ID NO:2中的第170位，或SEQ ID NO:5、29或44中的第158位，或SEQ ID NO:32、35、38、41或47中的第171位；并且在其它实施方案中，对在前述位置处的半胱氨酸的所述取代选自G或R；对SEQ ID NO:8或11的第171位的酪氨酸的所述取代选自G、R、P、A、V、S、N、Q或D；并且在其它实施方案中，对在前述位置处的酪氨酸的所述取代选自G或R；对在以下位置处的丙氨酸的所述取代选自G、R、P、V、S、N、Q或D：SEQ ID NO:17的第158位，或SEQ ID NO:23或26的第171位；并且在其它实施方案中，对在前述位置处的丙氨酸的所述取代选自G或R；对SEQ ID NO:20的第171位的脯氨酸的所述取代选自G、R、A、V、S、N、Q或D；并且在其它实施方案中，对在前述位置处的酪氨酸的所述取代选自G或R；对在以下位置处的精氨酸的所述取代选自L或N：SEQ ID NO：2的第204位，或SEQ ID NO：5、17、29或44的第192位，或SEQ ID NO：8、11、14、20、23、26、32、35、38、41或47的第205位；对在以下位置处的精氨酸的所述取代选自P、N或A：SEQ ID NO:2的第326位，或SEQ ID NO:5的第314位，或SEQ ID NO:8或14的第327位，或SEQ ID NO:11的第324位，或SEQ ID NO:17的第311位，或SEQ ID NO:20的第321位，或SEQ ID NO:23或26的第322位，或SEQ ID NO:29的第310位，或SEQ ID NO:32、35、38、41或47的第323位，或SEQ ID NO:44的第309位；对SEQ ID NO:20的第321位的苏氨酸的所述取代选自P、N或A；对SEQ ID NO:2或5的第329位的甘氨酸的所述取代选自N、L、T或S；以及对在以下位置处的谷氨酸的所述取代选自N、L、T或S：SEQ ID NO:8或14的第330位，或SEQ ID NO:11的第327位，或SEQ ID NO:17的第311位，或SEQ ID NO:20的第324位，或SEQ ID NO:23或26的第325位，或SEQ ID NO:29的第313位，SEQ ID NO:32、35、38、41或47的第326位，或SEQ ID NO:44的第312位。3.如权利要求1或2所述的TdT变体，其中：对于SEQ ID NO:2，第327位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:5，第315位的谷氨酸被取代；对于SEQ ID NO:8，第328位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:11，第325位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:14，第328位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:17，第312位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:20，第322位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:23，第323位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:26，第323位的甲硫氨酸被取代；对于SEQ ID NO:29，第311位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:32，第324位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:35，第324位的谷氨酰胺被取代；
对于SEQ ID NO:38，第324位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:41，第324位的谷氨酰胺被取代；对于SEQ ID NO:44，第310位的谷氨酰胺被取代；和对于SEQ ID NO:47，第324位的谷氨酰胺被取代。4.如权利要求3所述的TdT变体，其中所述谷氨酰胺被选自以下的氨基酸取代：T、F、L、M、I、V和Y。5.如权利要求1、2、3或4中任一项所述的TdT变体，其中所述3
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修饰的核苷酸选自：3
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氨基
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三磷酸脱氧核苷、...
【专利技术属性】
技术研发人员：米哈伊尔，
申请(专利权)人：DNA斯克瑞普特公司，
类型：发明
国别省市：
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