一种新型CRISPR相关转座酶制造技术

本发明专利技术公开了一种新型CRISPR相关转座酶，其来源于半透明假交替单胞菌KMM520，可识别16种PAM，可以一次将货物基因插入至8个位点，效率100％，高于来源于霍乱弧菌Tn6677的CRISPR相关转座酶；转座15.4kb货物基因至对应靶点的效率为100％，能够与来源于霍乱弧菌Tn6677的CRISPR相关转座酶在同一大肠杆菌内使用，且互不干扰地发挥功能，应用前景广阔。应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种新型CRISPR相关转座酶


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体地说，涉及一种新型CRISPR相关转座酶及其在基因编辑中的应用。

技术介绍

[0002]在代谢工程中，可以通过调整酶基因的剂量与比值使代谢途径不同酶或不同代谢途径之间协调一致最大化总体反应速度。在细菌中提高基因表达盒剂量的最常用方式是质粒，但会遇到遗传稳定性问题。将基因表达盒逐个整合到细菌染色体上则耗时长，难以快速测试诸多构建方案。CRISPR
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Cas虽然可以切割基因组多拷贝序列或以crRNA阵列同时靶向多个不同序列，但受限于双链断裂的修复效率，难以一次性插入3个拷贝以上的基因表达盒。因此，需要一种更好的方法获得不同基因剂量的组合。
[0003]2019年，Broad研究所张锋研究组和哥伦比亚大学Sam Sternberg研究组公布了两项相似的研究成果：利用细菌转座基因，将DNA序列精确地插入基因组而不切割DNA。其中张锋研究组从蓝藻中抽提了一种转座酶，将其命名为CAST，即CRISPR相关转座酶(CRISPR
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associated transposase)。Sternberg研究组在霍乱弧菌中发现了一个独特的转座基因后，开发了一种名为INTEGRATE(Insertion of transposable elements by guide RNA
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assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件插入)的基因编辑工具，可以在基因组中插入大片段基因而不引入DNA断裂。该新技术INTEGRATE利用转座基因将DNA序列插入基因组而不切割DNA。CAST系统和INTEGRATE系统都可不依赖于同源重组将DNA片段通过转座整合到大肠杆菌染色体预设的位点，无抗性标记残留，无双链DNA断口。
[0004]专利技术人以CAST系统和INTEGRATE系统为基础，开发出了一种的多拷贝基因插入系统MUCICAT(参见专利文献CN202010083919.7)可以在5天得到染色体插入10拷贝货物基因(Cargo gene)的菌株，具有可编辑、快速、无marker、定点等优势，目前MUCICAT已被成功应用于酶工程菌株与代谢工程菌株的构建(Zhang,Y.,Multicopy chromosomal integration using CRISPR
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associated transposases.Acs Synthetic Biology,2020.)。然而，代谢工程与合成生物学通常涉及多酶或多条途径表达水平的优化。在一轮转座中，基于单一CRISPR相关转座酶的MUCICAT只能探索负载单或多基因的单一货物基因最优剂量，不能筛选多基因或途径的基因剂量的最优配比。目前还没有平行扩增多基因/途径的染色体拷贝数技术的报道。包含多个彼此正交的CRISPR相关转座酶的MUCICAT技术则有希望实现单一细胞中多基因或途径的同时独立扩增，形成含不同基因剂量配比的菌株文库从而筛选最优多基因或途径的剂量配比。
[0005]已知活性的CRISPR转座酶中，仅来源于霍乱弧菌Tn6677的I
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F3型CRISPR转座酶插入效率和中靶率均高(Klompe,S.E.,et al.,Transposon
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encoded CRISPR
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Cas systems direct RNA
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guided DNA integration.Nature,2019.571(7764):p.219
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225.)，来源于霍夫曼尼斯藻和柱状鱼腥藻的V
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K型(Jonathan Strecker et al.,RNA
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guided DNA insertion withCRISPR
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associated transposases.Science，2019)、杀鲑气单胞菌S44的
I
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F3型(Michael T.Petassi et al.,Guide RNA Categorization Enables Target Site Choice in Tn7
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CRISPR
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Cas Transposons.Cell,2020)、多变鱼腥藻和Peltigera membranacea cyanobiont 210A的I
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B型均效率低或/和脱靶率高(Makoto Saito,A.L.and Jonathan Strecker,Han Altae
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Tran,Rhiannon K.Macrae,Feng Zhang,Dual modes of CRISPR
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associated transposon homing.Cell,2021.)。

技术实现思路

[0006]根据现有技术的CRISPR转座酶的特点，理想的是，若有其他新型高效的CRISPR相关转座酶，或可与MUCICAT组成正交的CRISPR相关转座系统，应用于复杂的代谢工程与合成生物学设计中。为了实现这一目的，专利技术人对于其他微生物来源的CRISPR转座酶进行了广泛筛选，发现了来源于半透明假交替单胞菌KMM520(Pseudoalteromonas translucida KMM520)的I
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F3型CRISPR转座系统，其在大肠杆菌中具有不亚于、甚至更优于霍乱弧菌Tn6677的插入效率，且能与霍乱弧菌Tn6677互不干扰地分别靶向插入eda
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purT间和lacZ位点。该新型CRISPR转座系统可识别所有16种PAM，没有PAM依赖性。
[0007]因此，本专利技术的第一个方面在于提供一种CRISPR相关转座酶，其包括选自下组的多肽：来源于假交替单胞菌属细菌的转座酶蛋白tnsA、来源于假交替单胞菌属细菌的转座酶蛋白tnsB、来源于假交替单胞菌属细菌的转座酶蛋白tnsC、来源于假交替单胞菌属细菌的转座酶蛋白tniQ、来源于假交替单胞菌属细菌的核酸酶蛋白Cas5/8、来源于假交替单胞菌属细菌的核酸酶蛋白Cas6、来源于假交替单胞菌属细菌的核酸酶蛋白Cas7。
[0008]优选地，所述假交替单胞菌属细菌是半透明假交替单胞菌。更优选所述半透明假交替单胞菌是半透明假交替单胞菌KMM520(Pseudoalteromonas translucida KMM520)。
[0009]在一种具体的实施方式中，上述CRISPR相关转座酶优选包括选自下组的多肽：
[0010]tnsA：其为具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO:1有95％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性、且功能相同的多肽；
[0011]tnsB：其为具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO:2有95％以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR相关转座酶，其包括选自下组的多肽：来源于假交替单胞菌属细菌的转座酶蛋白tnsA、来源于假交替单胞菌属细菌的转座酶蛋白tnsB、来源于假交替单胞菌属细菌的转座酶蛋白tnsC、来源于假交替单胞菌属细菌的转座酶蛋白tniQ、来源于假交替单胞菌属细菌的核酸酶蛋白Cas5/8、来源于假交替单胞菌属细菌的核酸酶蛋白Cas6、来源于假交替单胞菌属细菌的核酸酶蛋白Cas7。2.如权利要求1所述的CRISPR相关转座酶，其特征在于，所述假交替单胞菌属细菌是半透明假交替单胞菌，优选所述半透明假交替单胞菌是半透明假交替单胞菌KMM520(Pseudoalteromonas translucida KMM520)。3.如权利要求2所述的CRISPR相关转座酶，其特征在于，所述tnsA是具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO:1有95％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性、且功能相同的多肽；所述tnsB是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO:2有95％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性、且功能相同的多肽；所述tnsC是具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO:3有95％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性、且功能相同的多肽；所述tniQ是具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO:4有95％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性、且功能相同的多肽；所述Cas5/8是具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO:5有95％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性、且功能相同的多肽；所述Cas6是具有SEQ ID NO:6氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO:6有95％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性、且功能相同的多肽；所述Cas7是具有SEQ ID NO:7氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO:7有95％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性、且功能相同的多肽。4.编码如权利要求1
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3中任一项中所述的多肽的基因。5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，编码具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽tnsA的基因是核苷酸序列SEQ ID NO:8，或者与SEQ ID NO:8有80％以上同源性、优选地85％以上同源性、更优地90％以上同源性、更优地95％以上同源性的多核苷酸；编码具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽tnsB的基因是核苷酸序列SEQ ID NO:9，或者与SEQ ID NO:9有80％以上同源性、优选地85％以上同源性、更优地90％以上同源性、更优地95％以上同源性的多核苷酸；编码具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽tnsC的基因是核苷酸序列SEQ ID NO:10，或者与SEQ ID NO:10有80％以上同源性、优选地85％以上同源性、更优地90％以上同源性、更优地95％以上同源性的多核苷酸；编码具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽tniQ的基因是核苷酸序列SEQ ID NO:11，或者与SEQ ID NO:11有80％以上同源性、优选地85％以上同源性、更优地90％以上同源性、更优地95％以上同源性的多核苷酸；编码具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的多肽Cas5/8的基因是核苷酸序列SEQ ID NO:12，或者与SEQ ID NO:12有80％以上同源性、优选地85％以上同源性、更优地90％以上同源性、
更优地95％以上同源性的多核苷酸；编码具有SEQ ID NO:6氨基酸序列的多肽Cas6的基因是核苷酸序列SEQ ID NO:13，或者与SEQ ID NO:13有80％以上同源性、优选地85％以上同源性、更优地90％以上同源性、更优地95％以上同源性的多核苷酸；编码具有SEQ ID NO:7氨基酸序列的多肽Cas7的基因是核苷酸序列SEQ ID NO:14，或者与SEQ ID NO:14有80％以上同源性、优选地85％以上同源性、更优地90％以上同源性、更优地95％以上同源性的多核苷酸。6.一种用于CRISPR转座子系统的质粒pQCascade或称pQCascadePtr，其特征在于，包括选自下组的基因片段：如权利要求4或5中所述的Cas5/8编码基因；如权利要求4或5中所述的Cas6编码基因；如权利要求4或5中所述的Cas7编码基因；如权利要求4或5中所述的tniQ编码基因。7.如权利要求6所述的质粒pQCascadePtr，其特征在于，所述crRNA序列的间隔序列spacer是靶向基因组中单个位点的spacer，或者是靶向基因组中多个位点的crRNA阵列。8.如权利要求7所述的质粒pQCascadePtr...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晟，杨思琪，张译文，徐佳琪，张姣，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：