【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体小檗碱桥酶突变体及其应用。
技术介绍
1、小檗碱桥酶属于黄素腺嘌呤二核苷酸氧化酶(fad-linked oxidases)家族中的类小檗碱桥酶(berberine bridge enzyme(bbe)-like enzymes)亚家族，具有典型的fad结合结构域和底物结合结构域，能够催化氧化网状番荔枝碱生成金黄紫菫碱。该亚家族成员在真菌233个种中发现有6382条序列，在60种植物中有1372条序列，520种细菌中有1156条序列，11种古菌中有20条序列。
2、小檗碱桥酶是氧化网状番荔枝碱的关键一步，同时也是引导网状番荔枝碱向原小檗碱类生物碱，苯并菲啶类生物碱和苯酞异喹啉类生物碱合成的关键反应。在前期的研究中，通过截短和融合肽表达，来源于加州罂粟的小檗碱桥酶，虽然显示了增强的氧化活性，但是有限的工程化手段和少量的原小檗碱类产物生成，表明对小檗碱桥酶的工程化改造还有很大的提升空间。
技术实现思路
1、本专利技术提供小檗碱桥酶或其变体，其：
2、(1)具有seq id no:1或seq id no:2所示的序列，
3、(2)具有seq id no:1所示的序列并且在选自以下的1个、2个、3个或更多个位点具有突变：f398、a400、w177、s292、l294、n402、i431，所述突变是氨基酸残基的取代、缺失或添加，
4、(3)具有seq id no:2所示的序列并且在对应于seq id no:1的(2)中所
5、(4)是(1)的截短变体，具有seq id no:1第36-554位氨基酸，或seq id no:2第25-533位氨基酸，
6、(5)具有与(1)-(4)所示的序列具有至少70％相同性并保留小檗碱桥酶活性的序列。
7、在一个或多个实施方案中，(2)中所述的突变包括选自以下任一组的位点处的突变：(a)a400和i431，(b)f398和a400，和(c)f398和i431。
8、在一个或多个实施方案中，f398突变为w。
9、在一个或多个实施方案中，a400突变为v或i。
10、在一个或多个实施方案中，w177突变为f。
11、在一个或多个实施方案中，s292突变为非y的氨基酸。
12、在一个或多个实施方案中，l294突变为f
13、在一个或多个实施方案中，n402突变为非q的氨基酸。
14、在一个或多个实施方案中，i431突变为f。
15、在一个或多个实施方案中，所述突变包含选自以下任一组的突变：
16、(1)f398w、(2)a400i、(3)i431f、(4)a400i和i431f、(5)f398w和a400i、(6)f398w和i431f。
17、在一个或多个实施方案中，(5)所述序列源自罂粟科或毛茛科植物，优选源自蓟罂粟属或黃连属植物，更优选源自蓟罂粟(argemone mexicana)或日本黄连(coptisjaponica)。
18、本专利技术还提供融合多肽，包含本文第一方面所述小檗碱桥酶或其变体和其它多肽。在一些实施方式中，其他多肽位于所述小檗碱桥酶或其变体的n端和/或c端。在一些实施方式中，其他多肽包括将小檗碱桥酶或其变体定位到不同细胞器或亚细胞器的多肽、用于纯化的标签或者用于免疫印迹的标签。
19、本专利技术第一方面还提供核酸分子，包含选自以下的序列：
20、(1)编码本文第一方面所述小檗碱桥酶或其变体的核酸序列；
21、(2)(1)的互补序列。
22、在一个或多个实施方案中，(1)所述核酸序列经大肠杆菌密码子优化。
23、在一个或多个实施方案中，所述核酸序列是dna或rna。
24、在一个或多个实施方案中，所述核酸序列如seq id no:3或seq id no:4所示。
25、在一个或多个实施方案中，所述核酸序列包含seq id no:3截去第1-105位的核苷酸后的序列或seq id no:4截去第1-72位的核苷酸后的序列。
26、本专利技术还涉及上述核酸分子的变体，包括编码本专利技术小檗碱桥酶或其变体的片段、类似物、衍生物、可溶性片段和变体的核酸序列或其互补序列。
27、本专利技术另一方面还提供包含本文所述核酸分子的核酸构建物。
28、在一个或多个实施方案中，核酸构建物是载体，例如克隆载体、整合载体或表达载体。
29、在一个或多个实施方案中，所述核酸分子与表达控制序列操作性连接。
30、在一些实施方案中，表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒载体。
31、本专利技术还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞：
32、(1)表达本文任一实施方案所述的小檗碱桥酶或其变体，或
33、(2)包含本文任一实施方案所述的核酸分子和/或核酸构建物。
34、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在优选的实施方案中，所述大肠杆菌为k系大肠杆菌；更优选为大肠杆菌bl21(de3)。
35、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞还表达生产网状番荔枝碱所需的酶，所述酶选自以下的一个或多个或全部：酪氨酸羟化酶，多巴脱羧酶，去甲乌药碱合成酶，去甲乌药碱6’甲氧基转移酶，乌药碱氮甲基转移酶，3’羟基-氮甲基4’甲氧基转移酶。
36、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞还表达：
37、催化金黄紫堇碱生成四氢非洲防己碱的酶，优选为金黄紫堇碱9’氧甲基转移酶，
38、催化四氢非洲防己碱生成四氢小檗碱的酶，优选为四氢小檗碱氧化酶，
39、还原氧化态的细胞色素p450的酶，优选为细胞色素p450氧化还原酶。
40、本专利技术第一方面还提供一种催化氧化网状番荔枝碱生成氧化产物的方法，包括：使用本文任一实施方案所述的小檗碱桥酶或其变体催化网状番荔枝碱的步骤。
41、在一个或多个实施方案中，所述氧化产物是金黄紫菫碱。
42、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括：
43、催化生产网状番荔枝碱的步骤，和/或
44、催化金黄紫堇碱生成四氢非洲防己碱的步骤，和/或
45、催化四氢非洲防己碱生成四氢小檗碱的步骤，和/或
46、还原氧化态的细胞色素p450的步骤。
47、在一个或多个实施方案中，催化生产网状番荔枝碱的步骤包括：使用选自以下的一个或多个或全部的酶催化生产网状番荔枝碱：酪氨酸羟化酶、多巴脱羧酶、去甲乌药碱合成酶，去甲乌药碱6’甲氧基转移酶，乌药碱氮甲基转移酶，3’羟基-氮甲基4’甲氧基转移酶。
48、在一个或多个实施方案中，所述方法包含在适于氧化网状番荔枝碱生本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.小檗碱桥酶或其变体，其：
2.如权利要求1所述的小檗碱桥酶或其变体，其特征在于，
3.一种核酸分子，包含选自以下的序列：
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，(1)所述核酸序列具有选自以下的一项或多项所述的序列：
5.一种核酸构建物，含有权利要求3或4所述的核酸分子，
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞：
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还表达：
8.如权利要求6或7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
9.一种催化氧化网状番荔枝碱生成氧化产物的方法，包括：使用权利要求1或2所述的小檗碱桥酶或其变体催化网状番荔枝碱的步骤，
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述方法包含在适于氧化网状番荔枝碱生成氧化产物的条件下培养权利要求6-8中任一项所述的宿主细胞的步骤。
【技术特征摘要】
1.小檗碱桥酶或其变体，其：
2.如权利要求1所述的小檗碱桥酶或其变体，其特征在于，
3.一种核酸分子，包含选自以下的序列：
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，(1)所述核酸序列具有选自以下的一项或多项所述的序列：
5.一种核酸构建物，含有权利要求3或4所述的核酸分子，
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞：
7.如权利要求6所述的宿主细胞，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，刘海利，张前，李建华，孙雨伟，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
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